Поиск

Полнотекстовый поиск:
Где искать:
везде
только в названии
только в тексте
Выводить:
описание
слова в тексте
только заголовок

Рекомендуем ознакомиться

'Документ'
Авторитаризм — политический режим власти, не ограниченной правом, опирающейся на прямое насилие и осуществляемой единоличным правителем или правящей э...полностью>>
'Исследование'
Общая формулировка проблемы. При использовании оптимальной аэрозольной технологии для защиты растений и для более эффективных стратегий применения но...полностью>>
'Документ'
В настоящее время «Интеллектуальное здание» становится неотъемлемой частью инфраструктуры практически любого современного здания (офиса, бизнес-цент...полностью>>
'Программа'
Введение в терминологию искусственного интеллекта. Основные термины и понятия искусственного интеллекта (ИИ). Предметная область. Проблемная область....полностью>>

Молекулярные механизмы формирования множественной лекарственной резистентности у Burkholderia pseudomallei и близкородственных видов микроорганизмов 03. 00. 07 микробиология 03. 00. 15 генетика

Главная > Автореферат
Сохрани ссылку в одной из сетей:

Рис. 3. SDS-PAGE белков наружных мембран клеток B. pseudomallei 57576 SMCP (1) и B. pseudomallei 57576 SMRТ21 (2).

Таким образом, результаты серии экспериментов по получению и первичной характеристике инсерционных Bop- мутантов показали, что отдельные протеины наружной мембраны (110, 71, 48, 27 и 21 kDa) могут непосредственно участвовать в процессах формирования у патогенных видов Burkholderia резистентности высокого уровня к антибиотикам фторхинолоновой и цефалоспориновой групп.

В целом, полученные результаты свидетельствовали в пользу того, что мембранные протеины, уровень продукции которых был ассоциирован с измененной чувствительностью к антибиотикам, являются компонентами транспортных систем, участвующих в активном выбросе антибатериальных препаратов из клеток во внешнюю среду либо обеспечивающих селективное проникновение антибиотиков в клетку извне.

Проницаемость клеточных мембран и эффлюкс антимикробных соединений у полирезистентных вариантов Burkholderia. Для дальнейшей оценки роли систем мембранного транспорта в развитии множественной антибиотикорезистентности мы провели сравнительные исследования проницаемости клеточных оболочек, процессов энергозависимого эффлюкса антимикробных соединений и их аналогов, и изменений в продукции и транспорте отдельных внеклеточных и поверхностных биополимеров у штаммов буркхольдерий, отличающихся чувствительностью к антибиотикам.

Известно, что наружные мембраны клеток грамотрицательных бактерий служат эффективным барьером, ограничивающим поступление из внешней среды различных соединений, ограничивающих жизнеспособность микроорганизмов (Nikaido, Vaara,1985; Vaara, 1992). Исходно низкая проницаемость поверхностных структур клетки для ряда антимикробных соединений является одной из составляющих внутренней, природной лекарственной резистентности (intrinsic resistance) у ряда видов бактерий. Активация эффлюкс-систем клетки также вносит свой вклад в реализацию резистентности к токсичным для микроба соединениям. Имея в своем распоряжении ряд штаммов с измененной чувствительностью к антибиотикам, мы попытались оценить соотношение снижения проницаемости мембран и процессов эффлюкса в феномене развития множественной лекарственной устойчивости у возбудителя мелиоидоза.

Изучение уровня устойчивости исходных и мутантных штаммов к ряду неспецифических ингибиторов, способных к эффективному проникновению через мембраны бактериальных клеток (жирные кислоты, соли желчных кислот, детергенты и красители) показали существенное снижение мембранной проницаемости полирезистентных мутантов B. pseudomallei для целого ряда соединений различной химической природы и физико-химических свойств. Для оценки составляющей активного эффлюкса в реализации резистентности к антибиотикам и неспецифическим ингибиторам мы исследовали влияние блокаторов мембранного транспорта на уровень устойчивости мутантов и штамма дикого типа к отдельным антибиотикам, а также процессы аккумуляции и выведения из клеток микроорганизмов бромистого этидия (EtBr), часто используемого в анализе транспортных мембранных систем в качестве структурного аналога антимикробных соединений фторхинолонового ряда (Kumar, Worobec, 2002; Godreuil et al., 2003; Brenwald et al., 2003; Xu et al., 2003; Rouquette-Loughlin et al., 2003; Li et al., 2004; Rafii et al., 2005; Martins et al., 2006).

Полученные нами результаты выявили существенную разницу в скорости накопления и количестве аккумулированного красителя в клетках штамма дикого типа и мутантов с высоким уровнем устойчивости к фторхинолоновым и цефалоспориновым антибиотикам, при этом мутантные штаммы с преобладающей устойчивостью к фторхинолоновым соединениям характеризовались отчетливо меньшей проницаемостью мембран для данного соединения (рис. 4). Анализ процессов эффлюкса EtBr показал, что максимальная скорость выброса ингибитора была у клеток полирезистентных мутантов (рис. 4).

Энергозависимый характер процесса выброса бромистого этидия клетками мутантного штамма B. pseudomallei был продемонстрирован в серии дальнейших экспериментов при исследовании влияния температуры и наличия источника энергии в среде на кинетику эффлюкса EtBr (рис. 5).

A

B

Рис. 4. Динамика накопления (А) и выброса (В) бромистого этидия клетками B. pseudomallei 56770 и мутантов с множественной антибиотикорезистентностью.

4C

Рис. 5. Динамика выброса бромистого этидия клетками B. pseudomallei 56770 SMOC при различных температурах (А) и наличии источника энергии (В).

Взятые вместе, результаты проведенных исследований подтверждали значимую роль эффлюкса антимикробных соединений при формировании резистентности множественного характера, в связи с чем нами был проведен ряд дополнительных экспериментов по оценке влияния верапамила - соединения, блокирующего мембранные транспортеры (Ng et al., 1994; Banerjee et al., 1996; Choudhuri et al., 2002; Lee et al., 2003), на уровень резистентности исходного и мутантных штаммов B. pseudomallei к антибиотикам различных групп (рис. 6).

Как показал проведенный анализ, присутствие верапамила в целом приводило к снижению устойчивости исходных и мутантных штаммов к антимикробным соединениям, однако характер снижения отличался в каждом конкретном случае. Так, исследование динамики выживания клеток штамма дикого типа и мутантов под воздействием гентамицина продемонстрировала тенденцию к снижению числа жизнеспособных клеток в присутствии фиксированных концентраций верапамила, при этом у мутантных штаммов снижение выживаемости инокулума наблюдали лишь в определенных диапазонах концентраций антибиотика. Оценка влияния верапамила на выживаемость бактериального инокулума в присутствии фиксированных концентраций (субМПК по отношению к штамму дикого типа) антибактериальных препаратов различных групп в большинстве случаев также показала снижение количества жизнеспособных клеток, при этом угнетающее воздействие верапамила на рост культур полирезистентных мутантов хорошо прослеживалось на средах, содержащих препараты фторхинолоновой группы, тетрациклины и аминогликозиды. Отметим, однако, что набор антибиотиков, устойчивость к которым подавлялась верапамилом, для мутантных штаммов оказался существенно уже, чем для штамма дикого типа (рис. 6).

A

B

C

D

Рис. 6. Устойчивость штамма дикого типа B. pseudomallei 56770 (A) и его полирезистентныз производных B. pseudomallei 56770 SMPC PfxR CazR (B), B. pseudomallei 56770 SMCP CazR PfxR (C), B. pseudomallei 56770 SMOC OfxR CazR (D) к антибиотикам различных групп при воздействии блокатора мембранных каналов.

Изменения экспрессии поверхностных полисахаридов и систем секреции экзоферментов. Анализируя роль систем мембранного транспорта и изменения проницаемости клеточных оболочек в формировании антибиотикорезистентности у возбудителя мелиоидоза и близких ему видов Burkholderia, мы ставили перед собой в качестве одной из задач как можно более многоплановую оценку полирезистентных фенотипов у данной группы бактерий, в связи с чем нами были проведены исследования изменчивости некоторых поверхностных и внеклеточных биополимеров у полирезистентных мутантов B. pseudomallei, а именно изменений в структуре ЛПС, способности продуцировать экзополисахарид и внеклеточные ферменты «агрессии», то есть анализ модификации клеточных компонентов, причисляемых к факторам патогенности микроорганизма (Алексеев и др., 1984; Алексеев и др., 1994; Пивень, Илюхин, 2000; Brett, Woods, 2000).

Роль ЛПС, как внешнего барьера для различных антимикробных соединений, обусловлена его определенными физико-химическими характеристиками – анионными свойствами, числом межмолекулярных связей в коровом регионе и плотностью упаковки жирнокислотных цепей липида А (Snyder et al., 1999; Wiese et al., 1999). Барьерная функция ЛПС многократно подтверждена многочисленными исследованиями свойств мутантов различных видов бактерий, дефектных по продукции отдельных структурных компонентов ЛПС (Sukupolvi, Vaara, 1989; Plesiat, Nikaido, 1992; Vuorio, Vaara 1992; Helander et al., 1994; Helander et al., 1995; Plesiat et al., 1997; Plesiat, Vaara 1999; Nesper et al., 2001). Выявление возможных модификаций ЛПС при селективном воздействии антимикробных соединений, по нашему мнению, давало возможность более широко обозначить вероятные механизмы, лежащие в основе феноменологии множественной антибиотикорезистентности возбудителя мелиоидоза.

По данным SDS-PAGE, ЛПС-профили мутантов B. pseudomallei PfxR OfxR фенотипов отличались от исходного штамма числом и количественной выраженностью отдельных ЛПС-паттернов практически во всех диапазонах профиля - наблюдалась реаранжировка высокомолекулярных ( > 150 kDa) паттернов и существенная редукция числа низкомолекулярных (25 kDa и менее) фрагментов, что мы рассматриваем как свидетельство наличия структурных модификаций биополимера, сопряженных с возрастанием устойчивости к антибиотикам фторхинолоновой группы (рис. 7).

Рис. 7. SDS-PAGE ЛПС исходного штамма и полирезистентных мутантов B. pseudomallei. Окраска серебром. Штаммы: 1 – 56770; 2 – 56770 SMCP; 3 – 56770 SMPC; 4 – 56770 SMOC.

Логично предполагать, что изменения структуры ЛПС вносят свой вклад в изменение проницаемости клеточных оболочек мутантов B. pseudomallei и формирование устойчивости к отдельным антимикробным соединениям. Как было отмечено выше, структурные модификации ЛПС встречаются у мутантов различных видов бактерий с фенотипом множественной антибиотикорезистентности, часто, однако, изменения структуры ЛПС не являются ведущим фактором формирования резистентности, а скорее следствием комплексных адаптивных реакций клеток, тем не менее, дающим микроорганизмам дополнительные селективные преимущества (Chamberland et al., 1989; Rajyaguru, Muszynski, 1997; Ishikawa et al., 2002; Poole, 2002).

Экзополисахарид (капсульный полисахарид), продуцируемый многими видами грамотрицательных и грамположительных бактерий, является одним из важнейших факторов вирулентности (Pier et al., 1987; Cabral et al., 1987; May et al., 1991; Yu et al., 1995; Pier et al., 2001; Yu, Head 2002; Vuong et al., 2004), вместе с тем, неоднократно была показана роль экзополисахарида как экранирующего барьера в защите клеток бактерий от воздействия антибиотиков и антисептических соединений (Nickel et al., 1985; Morris et al., 1996; Vandenbroucke-Grauls, 1996; Desai et al., 1998; Ali et al., 2000; Hentzer et al., 2001; Campanac et al., 2002; Drenkard, Ausubel, 2002; Cunha et al., 2004; Arciola et al., 2005; Cerca et al., 2005). Подчеркнем также, что утрата способности продуцировать экзополисахарид также в отдельных случаях сопровождается повышением устойчивости микробов к некоторым группам антимикробных соединений, в частности, подобные особенности формирования резистентности к полипептидным антибиотикам были описаны у X. campestris, Sphingomonas spp. и E. coli (Pollock et al., 1994).

Исследования изменений продукции экзополисахарида у полирезистентных мутантов различных видов Burkholderia мы проводили с использованием двух методических подходов. Качественно способность продуцировать экзополисахарид оценивали методом, основанным на избирательном окрашивании экзополисахарид-негативных колоний микроорганизмов липофильным красителем судан черным В (Liu et al., 1998); для количественного соотнесения экзополисахарид-продуцирующей активности мутантных штаммов буркхольдерий за основу был взят метод окрашивания биопленок, формируемых бактериями на твердых субстратах (Ngwai et al., 2006). Результаты данной серии экспериментов приведены в таблице 3.

Табл. 3.

Продукция экзополисахарида исходными штаммами и полирезистентными мутантами различных видов Burkholderia

Штамм

Окрашивание

Судан черным В

Формирование

биопленок, А600 (р)

B. pseudomallei 56770

-

0.32 (0.01)

B. pseudomallei 56770 SMP

+

0.14 (0.05)

B. pseudomallei 56770 SMC

-

0.37 (0.01)

B. pseudomallei 56770 SMO

+

0.13 (0.01)

B. pseudomallei 56770 SMPC

+

0.17 (0.03)

B. pseudomallei 56770 SMCP

-

0.37 (0.02)

B. pseudomallei 56770 SMOC

-

0.29 (0.01)

B. mallei 10230

-

0.30 (0.01)

B. mallei 10230 SMP

+

0.11 (0.02)

B. mallei 10230 SMC

-

0.29 (0.02)

B. thailandensis E264

-

0.39 (0.03)

B. thailandensis E264 SMP

+

0.17 (0.01)

B. thailandensis E264 SMO

-

0.24 (0.07)

B. thailandensis E264 SMPC

-

0.27 (0.01)

B. cepacia 8235

-

0.36 (0.02)

B. cepacia 8235 SMPC

+

0.15 (0.02)

B. cepacia 8235 SMCP

-

0.39 (0.01)

B. cepacia 25416

-

0.34 (0.02)

B. cepacia 25416 SMPC

-

0.30 (0.03)

B. cepacia 25416 SMCP

-

0.35 (0.02)

При анализе данных, полученных в этой серии экспериментов, можно видеть, что дефекты в продукции экзополисахарида отмечались, прежде всего, у мутантных штаммов B. pseudomallei и B. mallei, имеющих высокий уровень устойчивости к препаратам фторхинолоновой группы, тогда как у мутантов, при получении которых в качестве селективных факторов первыми были использованы препараты группы цефалоспоринов, вообще не было выявлено вариантов со сниженной продукцией экзополисахарида, напротив, все штаммы этой группы обладали даже несколько более высокими показателями формирования биопленок (табл. 3).

Характер варьирования продукции экзополисахарида у мутантов буркхольдерий, принадлежащих к различным фенотипическим классам резистентности, по-видимому, является отражением изменений в экспрессии различных секреторных систем бактерий, в том числе, задействованных в транспорте компонентов данной поверхностной структуры. В пользу этого свидетельствуют также результаты изучения спектров внеклеточных ферментов полирезистентных мутантов.

Приобретение фенотипа множественной антибиотикорезистентности в ряде случаев может сопровождаться функциональной модификацией секреторных систем клеток I, II и IV типа (Poole, 2001; Poole, 2002; Poole, 2004; Poole, 2005; Marquez, 2005), что, как правило, приводит к значительным изменениям отдельных фенотипических свойств микроорганизмов. Как отмечалось ранее, некоторые из таких полирезистентных вариантов обладают повышенным уровнем продукции экзополисахарида и большей биофильм-формирующей способностью. Модификации спектров секретируемых белков, вызванные изменениями экспрессии секреторных аппаратов I, II (gsp, general secretory pathway) и IV типов, также является характерной особенностью изолятов с множественной антибиотикорезистентностью (Poole et al., 1993; Schlor et al., 1997; Hayashi et al., 2000; Peng et al., 2005; Linares et al., 2005; Gil et al., 2006; Zhu et al., 2006; Posadas et al., 2007).

Для оценки возможных модификаций секреторной активности полирезистентных мутантов B. pseudomallei мы исследовали спектры их экстрацеллюлярных протеинов и вариабельности ферментативной активности культуральных супернатантов бактерий. Полученные результаты обозначили определенную закономерность в изменении специфической экстрацеллюлярной энзимной активности у штаммов B. pseudomallei с различными фенотипами резистентности (рис. 8).

Мутанты, имеющие фенотип множественной резистентности, в целом, характеризовались снижением энзимной активности культуральных фильтратов, по сравнению с исходными штаммами и «монорезистентными» производными. Отметим, что полирезистентные варианты с высоким уровнем устойчивости к препаратам фторхинолонового ряда не продуцировали внеклеточных липаз и лецитиназ, кроме того, PfxR CazR фенотип практически полностью утрачивал экстрацеллюлярную протеолитическую активность (рис. 8).

Рис. 8. Ферментативная активность культурального супернатанта исходного штамма B. pseudomallei и мутантов, селекционированных в последовательности OfxR - CazR (A), PfxR - CazR и CazR - PfxR. Показаны средние значения диаметров зон гидролиза субстратов.

Таким образом, наряду со сведениями о характерных перестройках белкового спектра наружных мембран клеток, результаты анализа экспрессии поверхностных углеводсодержащих биополимеров и секреторной активности полирезистентных вариантов буркхольдерий, приведенные в данном разделе работы, являются еще одним подтверждением комплексного изменения процессов клеточного транспорта у исследуемых микроорганизмов при формировании устойчивости к антимикробным соединениям множественного типа. Судя по всему, эти изменения выражаются в модификации проницаемости клеточных оболочек и активации механизмов активного выведения антимикробных соединений из клеток во внешнюю среду. В число последних, по-видимому, вовлечены и sec-зависимые секреторные системы, ответственные за транспорт полипептидов и полисахаридных компонентов.

Эффлюкс-системы и развитие множественной антибиотикорезистентности Burkholderia

Системы лекарственного эффлюкса патогенных Burkholderia. В последнее время у грамотрицательных и грамположительных бактерий интенсивно изучается один из механизмов множественной лекарственной устойчивости, представленный системами активного энергозависимого транспорта и выброса антимикробных соединений из клеток во внешнюю среду (multidrug efflux) (Ma et al., 1994; Nikaido, 1994; Nikaido et al., 1998; Kohler et al., 1999; Van et al., 2000; Borges-Walmsley, Walmsley, 2001; Markham, Neyfakh, 2001; Poole, 2001; Poole, 2004; Saidijam et al., 2006). Большинство из выявленных транспортных систем резистентности специфичны для довольно узкого ряда структурно сходных субстратов, однако идентифицированы и мультиэкспортеры (multidrug efflux pumps), «оперирующие» с широким набором даже структурно различных антибиотических соединений (Nikaido, 1998; Zgurskaya, Nikaido, 2000). Известные на сегодня бактериальные лекарственные мультитранспортеры принадлежат к 6 различным функциональным семействам транспортных протеинов: ABC (ATP binding cassette), MFS (Major Facilitator Superfamily), RND (Resistance / Nodulation / Division), SMR (Small Multidrug Resistance), MATE (Multidrug and Toxic Compound Extrusion), MET (Multidrug Endosomal Transporter) (Paulsen et al., 2001).

Мы использовали технику дифференциального дисплея мРНК для исследования экспрессии последовательностей геномов, гомологичных некоторым известным на сегодняшний день efflux-детерминантам MFS, SMR и RND семейств транспортных протеинов, у исходных и мутантных штаммов B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis в процессе селективного воздействия антимикробными препаратами фторхинолоновой и цефалоспориновой групп. Первичным этапом этого раздела исследований был сравнительный анализ in silico нуклеотидных последовательностей известных и предполагаемых генов лекарственного эффлюкса B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis, выполненный с использованием биоинформационного программного обеспечения на основе опубликованных в Genbank последовательностей геномов буркхольдерий группы «pseudomallei».

Исследование представленных в Genbank геномных сиквенсов штаммов B. pseudomallei K96243, B. pseudomallei 1710b, B. mallei ATCC23344 и B. thailandensis E264 показали наличие большого числа кодирующих последовательностей, гомологичных детерминантам лекарственных транспортеров MFS типа. Группирование кодируемых обозначенными генами протеинов по числу точных соответствий в участках их аминокислотных последовательностей с использованием алгоритма Clustal W (Thompson et al., 1994) и оценка их гомологии известным MFS-протеинам показала, что около половины MFS эффлюкс-транспортеров B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis принадлежит к DHA2 (Drug/Hydrogen Antiport) семейству вторичных транспортеров, при этом большая часть из них высокогомологична лекарственным мультитранспортерам QacA/EmrB субсемейства, а небольшую группу составляют гомологи Bcr/CflA субсемейства (рис. 9).

Принадлежащие к данным группам транспортные белки различных бактериальных видов, как сообщалось, осуществляют энергозависимый выброс структурно разнородных антимикробных соединений из клеток во внешнюю среду (Putman et al., 2000; Saidijam et al., 2006).

Несомненный интерес представляет также характер локализации детерминант MFS-транспортеров в геномах B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis. Кодирующие последовательности MFS-протеинов расположены в области генных кластеров тРНК, транскрипционных регуляторов систем транспорта компонентов полисахарида, флагеллярных генов, генов консервативного метаболизма, генных кластеров секреторных систем II и III типов. Отметим также наличие последовательностей IS-элементов и генов транспозаз в непосредственной близости от локусов многих MFS-транспортеров, что позволяет предполагать важную роль транспозиционных событий в формировании этих фрагментов геномов.

Рис. 9. ClustalW дендрограмма соответствия аминокислотных последовательностей MFS-транспортеров B. pseudomallei K96243, B. pseudomallei 1710b, B. mallei ATCC23344 и B. thailandensis E264. Указано количество TMS белков и их принадлежность к отдельным семействам и субсемействам MFS.

Последовательности геномов B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis, гомологичные SMR транспортерам EmrE/QacE группы, как показал проведенный анализ, расположены на хромосоме 1 у всех трех видов буркхольдерий и локализованы в области генных кластеров, кодирующих компоненты консервативных метаболических путей и АТФ-зависимых секреторных систем. Сравнение аминокислотных последовательностей EmrE микроорганизмов группы «pseudomallei», других буркхольдерий и видов отдаленой гетерологии продемонстрировало полную идентичность этих протеинов у B. pseudomallei и B. mallei и отличия от них по 9 аминокислотам у соответствующего белка B. thailandensis. Оказалось также, что белок EmrE B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis структурно более сходен c SMR-транспортерами B. phymatum, B. phytofirmans, B. xenovorans, видов Ralstonia, Serracia и Klebsiella, чем с EmrE B. cenocepacia и некоторых других видов буркхольдерий (рис. 10).

Рис. 10. Аминокислотные последовательности EmrE различных видов Burkholderia и гетерологичных микроорганизмов. Оттенками выделены фрагменты с различной степенью идентичности аминокислотных последовательностей.

В отношении эффлюкс-детерминант, кодирующих транспортеры RND суперсемейства, анализ геномных сиквенсов B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis показал, что большинство из трехкомпонентных RND эффлюкс-систем у данных видов буркхольдерий локализовано на хромосоме 1 в областях генных кластеров транспортных систем аминокислот и азотистых оснований, генов синтеза и транспорта фимбриальных структур, систем секреции сидерофоров и гемолизинов (гомологов HlyB-HlyD), генов пуринового и липидного обмена, генов контроля клеточного цикла. В большинстве случаев, последовательности RND эффлюкс-систем представлены оперонами, состоящими из дивергентно транскрибируемого гена транскрипционного регулятора, гена вспомогательного белка MFP семейства, гена транспортера и гена порина наружной мембраны.



Скачать документ

Похожие документы:

  1. Е. С. Воронин и др.; Под ред. А. А. Сидорчука. М.: КолосС, 2007. 671 с, [18] л ил.: ил. Учебники

    Учебники
    Инфекционные болезни животных / Б. Ф. Бессарабов, А. А. Вашу-И74 тин, Е. С. Воронин и др.; Под ред. А. А. Сидорчука. — М.: КолосС, 2007. — 671 с, [18] л.

Другие похожие документы..