Поиск

Полнотекстовый поиск:
Где искать:
везде
только в названии
только в тексте
Выводить:
описание
слова в тексте
только заголовок

Рекомендуем ознакомиться

'Закон'
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ СРЕДСТВ, предусмотренных приложением 5 к Закону Самарской области «Об областном бюджете на 2006 год» по строке «Переселение граждан из ...полностью>>
'Кодекс'
Стаття 15. Відповідальність військовослужбовців та інших осіб, на яких поширюється дія дисциплінарних статутів, за вчинення адміністративних правопору...полностью>>
'Документ'
* Данные по электроэнергетике представляются по Свердловской области в целом, объемы производства по отрасли электроэнергетика в разрезе управленческ...полностью>>
'Программа'
Тренер: Усинас Владимир Станиславович Директор консалтинговой компании MARK BRAUS. Является членом ULI - the Urban Land Institute.Руководитель проект...полностью>>

Чупикова наталия Игоревна Получение и биологическая характеристика мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга человека и создание на их основе костных структур

Главная > Документ
Сохрани ссылку в одной из сетей:

На правах рукописи

ЧУПИКОВА Наталия Игоревна

Получение и биологическая характеристика

мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга человека и создание на их основе

костных структур

03.00.23 - биотехнология

16.00.03 – ветеринарная микробиология, вирусология,

эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

А в т о р е ф е р а т

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2007

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» (ФГОУ ВПО МГАВМиБ) и ООО «Институт Стволовой Клетки».

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор, член-корреспондент РАХН

Девришов Давудай Абдулсемедович;

доктор медицинских наук

Тепляшин Александр Сергеевич.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Тихонов Игорь Владимирович;

доктор биологических наук, профессор Манько Виктор Михайлович.

Ведущая организация – Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ГНУ ВНИТИБП).

Защита состоится ___________ 2007 года в _____ часов на заседании диссертационного совета Д.220.042.01 в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» (109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23. Тел. (495) 377-93-83).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО МГАВМиБ.

Автореферат разослан «___» ____________ 2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

профессор Грязнева Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Особую актуальность в настоящее время приобрели методы клеточной биотехнологии, которые позволяют получать культуры стволовых клеток, обладающих уникальной свойствами. Изучение физиологических особенностей, функций и локализации в организме различных типов стволовых клеток человека помогают понять механизмы регенерации и поддержания организма (Presnell S.C., 2002; Verfaillie C.M., 2002).

В связи с этим, перспективным подходом является использование мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга (ММСК КМ) человека в качестве источника получения тканей мезодермального происхождения, с целью применения в качестве средства заместительной терапии при лечении заболеваний опорно-двигательного аппарата человека и животных (Bruder S.P., 1998; Kassem M., 2004).

Решение поставленных вопросов зависит от дальнейшего усовершенствования методов выделения, культивирования и дифференцировки in vitro, а также методов получения трехмерных структур на основе ММСК и минеральных или органических матриксов.

Таким образом, изучение ММСК человека является актуальным для применения в ветеринарной и медицинской практике.

Цель и задачи исследований. Цель настоящих исследований – получение и биологическая характеристика ММСК КМ человека, а также разработка на основе этих клеток трехмерных трансплантатов костной ткани (ТТКТ).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести исследования по выделению и разработка оптимальных условий для долгосрочного культивирования ММСК КМ человека.

2. Изучить морфологические и иммуногенетические особенности ММСК КМ человека в культуре.

3. Изучить распределение ММСК КМ при внутривенном введении на модельных животных (мыши).

4. Создать трехмерные структуры костной ткани с использованием ММСК КМ человека и кальций-фосфатного (КФ) матрикса.

5. Провести доклиническое изучение полученных костных трансплантатов на экспериментальных мышах и овцах.

Научная новизна. Впервые проведен сравнительный анализ методов выделения ММСК и предложен усовершенствованный метод. Для выделения популяции ММСК определен параметр центрифугирования Равный 3000 об/мин. Разработаны оптимальные условия для длительного культивирования ММСК КМ человека. Впервые в России проведен широкий анализ антигенов, характеризующих ММСК.

Впервые, с учетом морфологических особенностей клеток представлены данные об оптимальном соотношении количества клеток на объем матрикса с учетом пористости носителя. Впервые показана зависимость плотности заполнения матрикса на дифференцировку клеток. На основе гистологических и иммуногистохимических методов доказано, что в результате культивирования in vitro ММСК КМ в матриксе в дифференцировочной среде получены трехмерные структуры костной ткани. Показано, что при эктопическом введении полученных трансплантатов в организм мышей, они не являются токсичными и не проявляют свойств туморогенности.

Впервые в России проведены предклинические испытания по влиянию полученных костных трансплантатов на организм овцы при смоделированных костных травмах.

Практическая значимость. Разработанный способ выделения ММСК КМ используется для получения и наращивания клеточной массы для последующей криоконсервации и длительного хранения для клинических целей (клиника «Бьюти Плаза»).

Метод получения и наращивания ММСК животных используется на кафедре иммунологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ в научно-исследовательской работе и учебном процессе.

В ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН используются биотрансплантаты костной ткани для клинического изучения.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертационной работы доложены на международном симпозиуме и европейской научно-практической конференции (Германия, 2004); международном симпозиуме по биологии клетки в культуре (Санкт-Петербург, 2004); Российском симпозиуме «Лазерная медицина» (Москва, 2004); II Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005); на 4-ом ежегодном съезде Европейского общества по тканевой инженерии (Германия, 2005); международной конференции «Surface – Tissue Interaction» (Швейцария, 2005); Всемирной конференции по тканевой инженерии, 8-ом ежегодном съезде международного общества тканевой инженерии (Китай, 2006); 3-ем Московском международном конгрессе «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006); VI съезде аллергологов и иммунологов СНГ, Российском Национальном конгрессе аллергологов и иммунологов, III Российской конференции по иммунотерапии (Москва, 2006); на XI съезде международного общества по тканевой инженерии, европейском международном симпозиуме (Нидерланды, 2006).

На защиту выносятся следующие положения и результаты:

1. Усовершенствованный метод выделения, физиологическая характеристика и условия культивирования ММСК.

2. Способ получения трехмерных структур костной ткани.

3. Доклиническое изучение полученных биоимплантов в организме иммунодефицитных животных и мелкого рогатого скота in vivo.

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 4 статьи в научных журналах, 10 статей в сборниках научных трудов.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 130 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (167 источников, из которых 10 отечественных и 157 иностранных). Работа содержит 10 таблиц, 19 рисунков, 8 страниц приложений.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований

Работа выполнена в период с 2003 по 2007 год на кафедре иммунологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ и ООО «Институт стволовой клетки».

В экспериментах использовали стандартные питательные среды и растворы отечественного и зарубежного производства. Культивирование клеток проводили в инкубаторе фирмы Sanyo (Япония).

Костный мозг 20 здоровых доноров был получен в клинике «Бьюти Плаза», методом пунктирования гребня подвздошной кости. ММСК КМ получали методом центрифугирования в градиенте плотности фиколла. Полученную популяцию клеток переносили в культуральный матрас из расчета 1 млн. клеток на 1 см2.

Морфологическую оценку ММСК КМ проводили с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Изучение клеточных популяций проводили путем анализа клеток, окрашенных иодитом пропидия по пяти клеточным культурам.

Начиная с 1-го пассажа, анализировалось влияние подложек и ростовых факторов на длительность культивирования ММСК КМ.

Подготовку проб для кариологического анализа проводили по стандартной методике с использование раствора колхицина. Хромосомные препараты анализировали методом GTG-окрашивания.

Окрашивание поверхностных маркеров полученной культуры ММСК КМ проводили по методике, описанной Zeille G. (1980) и Collotta F. (1984). Было проанализировано 270 проб клеточной суспензии от 9 доноров.

Анализ локализации ММСК КМ человека в организме животных проводили на 20 самках мышей линии Balb/C nude с помощью ПЦР-анализа по Y-хромосоме на 21-е сутки.

Способность ММСК пяти клеточных линий к дифференцировке в клетки мезодермального ряда и специфическое окрашивание проводилось по Pittenger (1999) и Reyes (2001).

Окраска на специфические антитела проводилась с использованием коммерческого набора DAB-kit (Chemicon, США). Молекулярный анализ дифференцированных клеток проводился методом ОР-ПЦР.

Для создания ТТКТ использовали матриксы BD СаР (BD Biosciences, Германия) и СаР матриксы (Канада) и ММСК КМ человека. После насыщения матрикса клетками, трехмерные структуры культивировали в остеогенной среде в течение 4 недель.

Доклинические испытания проводились на 16 мышах (Balb/C nude). Для оценки токсичности и туморогенности, ТТКТ вшивали подкожно иммунодефицитным мышам в область спины на срок 8 недель.

Клиническое изучение ТТКТ проводили на 9 овцах романовской породы путем моделирования перелома плюсневой кости размером 3,5 см. В эксперименте исследовали 3 группы: 1- контрольный перелом; 2 – в место перелома помещали КФ матрикс без клеток; 3 - в место дефекта помещали ТТКТ. Фиксацию проводили с помощью аппарата Илизарова. У овец в течение срока наблюдения (1 месяц) изучали динамику изменений гематологических и биохимических показателей периферической крови.

Экспериментальные данные обрабатывали методом среднестатистического анализа и с помощью программ CXP v. 2.1 и MultiCycle.

В выполнении отдельных этапов работы принимали участие д.б.н., проф. Савченкова И.П., к.б.н. Коржикова С.В., Шарифуллина С.З. (ООО «Институт стволовой клетки»), сотрудники кафедры иммунологии и кафедры хирургии ФГОУ ВПО МГАВМиБ, ГУ РОНЦ им. Н.И. Блохина РАМН и ИБХ им. Ю.А. Овчинникова и М.М. Шемякина РАН, за что автор им искренне благодарен.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Оптимизация условий выделения и культивирования ММСК КМ

При выделении ММСК КМ сравнивали несколько способов разделения в градиенте фиколла с разными параметрами осаждения клеток, результаты, которых представлены в таблице 1.

Табл. 1. Зависимость количества полученных ММСК от параметров центрифугирования

Параметры центрифугирования в градиенте фиколла, об/мин

Кол-во клеток в мононукл. фракции, млн. кл.

Кол-во клеток после лизиса, млн. кл.

Кол-во ММСК через 7 дней культивирования, млн.кл.

2000

22,7  0,8

14,9  0,3

2,35  0,18

2500

27,2  1,3

14,2  0,9

2,55  0,14

3000

21,4  0,6

14,3  0,3

3,25  0,08

3500

23,8  1,1

14,5  0,8

2,9  0,17

Сравнительный анализ эффективности выделения ММСК при различных параметрах центрифугирования показал, что режим, составляющий 3000 об./мин. является наиболее оптимальным. При таких параметрах в получаемой мононуклеарной фракции содержится наименьшее количество клеток крови, мешающих росту культуры ММСК, а выделенная популяция ММСК к 10 суткам культивирования достигает монослоя.

При анализе влияния различных подложек, а также при добавлении к среде для культивирования ростовых факторов было установлено, что культивирование на подложках на основе коллагена, фибронектина, желатина способствует поддержанию культуры в недифференцированном состоянии. Добавление в среду для культивирования фактора роста фибробластов или его комбинации с фактором роста эндотелия усиливает эффект влияния подложек.

Таким образом, полученные нами данные являются оптимальными для культивирования и позволяют пассировать клетки без спонтанной дифференцировки в культуре более 15 пассажей.

Морфологические особенности ММСК КМ в культуре

ММСК обладали фибробластоподобной морфологией, высокой адгезивностью, клоногенностью, способностью многократно пролиферировать в культуре (более 60 генераций) (рисунок 1).

а) б)

Рис.1 Морфология и особенности роста в культуре ММСК КМ

а) популяция ММСК через 7 дней после выделения; х100; б) образование колоний in vitro, х40

Время цитогенерации составило 56-60 часов, а митотический индекс - 31‰. Полученные данные согласуются с данными, полученными в других лабораториях (Zohar et al., 1997; Colter et al., 2000; Hung et al., 2002) и подтверждают, что полученная нами популяция клеток обладает основным характеристиками и особенностями роста ММСК в культуре in vitro.

Анализ ММСК КМ в динамике культивирования in vitro

Анализ клеточной линии на 3 пассаже, при прохождении клетками 32 цитогенераций, показал нормальный, диплоидный кариотип культуры. Также культура клеток была проанализирована на 10 пассаже (клетки прошли 70 цитогенераций). Кариотип данной культуры клеток 46, ХХ, без анеуплоидии и структурных перестроек хромосом.

Таким образом, анализ хромосом позволил сделать заключение, что линия имеет диплоидный кариотип 46, ХХ, не меняющийся во время долгосрочного культивирования.

Культуры клеток были проанализированы по основным параметрам в фазе логарифмического роста. Данные приведены в таблице 2.

Табл. 2. Анализ клеточных культур в фазе log-роста

№ образца

Количество делящихся клеток (S+G2+M)

Индекс ДНК (G2/G1)

Количество живых клеток (%)

Количество клеток в апоптозе (%)

1

11,6%

1,96

91,7

7,2

2

12,3%

1,96

87,8

10,8

3

9,5%

1,958

90,0

5,7

По результатам анализа выявлено, что основной пул клеток находится в G0-фазе, от 9,5 до 11,6% культуры постоянно делится, что соответствует характеристике ММСК. Отношение количества ДНК для клеток, находящихся в G2-фазе к количеству ДНК в G1-фазе клеточного цикла равно 1,96, что характеризует нормально развивающуюся культуру.

При длительном культивировании количество генетического материала не менялось. Коэффициент распределения D.I. для культуры клеток ММСК КМ 2 пассажа - 1,3, D.I. 9 пассажа - 1,32. Эти данные соответствуют норме и характеризуют стабильность количества ДНК при длительном пассировании полученной культуры.

Анализ поверхностных маркеров, выделенной популяции ММСК

Среднестатистические данные профиля экспрессии поверхностных антигенов по 9 образцам ММСК приведены в таблице 3.



Скачать документ

Похожие документы:

  1. Программа 30 мая 2007 год 9 часов 00 минут 10 часов 00 минут регистрация участников

    Программа
    3) 10 часов 20 минут – Бочков Н.П.1, Константинов А.Б.1, Миланов Н.О.1, Гольдштейн Д.В.2 1ГУ Российский научный центр хирургии имени академика Б.В.Петровского и 2ЗАО «РеМеТекс», Москва.

Другие похожие документы..