Поиск

Полнотекстовый поиск:
Где искать:
везде
только в названии
только в тексте
Выводить:
описание
слова в тексте
только заголовок

Рекомендуем ознакомиться

'Документ'
Метрологія, стандартизація та сертифікація. Сутність та взаємозв'язок дис­циплін. Необхідність та затребуваність у технічних галузях та суспільному ж...полностью>>
'Доклад'
Субвенция – предназначена для выплаты заработной платы, налогов в бюджет и внебюджетные фонды, пособий молодым специалистам, пенсионерам при увольнен...полностью>>
'Автореферат диссертации'
в час на заседании диссертационного совета Д 001.037.01 в Научно-исследовательском институте региональной патологии и патоморфологии СО РАМН по адрес...полностью>>
'Документ'
конференции «Проблемы устойчивого развития регионов Республики Беларусь и сопредельных стран», которая состоится 27-29 марта 2012 года в УО «Могилевс...полностью>>

Учебное пособие составлено в соответствии с программой по биохимии для студентов всех факультетов медицинских вузов. Оно предназначено для самостоятельной подготовки студентов и оптимизации их работы на практических занятиях

Главная > Учебное пособие
Сохрани ссылку в одной из сетей:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Нижегородская государственная медицинская академия

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Кафедра биохимии им. Г.Я. Городисcкой

РУКОВОДСТВО

К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

ПО БИОХИМИИ

Нижний Новгород

2010

Руководство к практическим занятиям по биохимии. -Нижний Новгород: издательство Нижегородской государственной медицинской академии, 2010.

Учебное пособие составлено в соответствии с программой по биохимии для студентов всех факультетов медицинских вузов.

Оно предназначено для самостоятельной подготовки студентов и оптимизации их работы на практических занятиях.

Составители:

Зав. кафедрой, д.б.н. Е.И. Ерлыкина (общая редакция), доценты к.м.н. С.П. Калашников, к.м.н. П.П. Загоскин, к.б.н. Е.И. Кузьмина, к.м.н. Т.И. Шлапакова, ст. преподаватели к.б.н. Т.С. Семенова, к.м.н. Л.И. Якобсон, ассистенты В.П. Французова, Т.Ф. Сергеева, к.б.н. О.И. Коновалова, к.б.н. О.В. Баринова.

Печатается по решению Методической комиссии по естественно-научным дисциплинам.

© Коллектив авторов, 2010

Предисловие

Предлагаемое вашему вниманию учебное пособие составлено на основе многолетнего опыта работы преподавателей кафедры биологической химии им. Г. Я. Городисской Нижегородской государственной медицинской академии.

Пособие построено по принципу систематизации полученных знаний по биохимии на основе проведения лабораторной работы, обсуждения полученных результатов и закрепления теоретического материала.

Руководство составлено в соответствии с программой по курсу биохимии, рекомендованной МЗ РФ.

Учебное пособие содержит:

- введение к соответствующему разделу биохимии, биомедицинское значение тем лабораторных занятий,

- методики выполнения практических работ,

- теоретические вопросы для подготовки студентов к аудиторным занятиям и зачетам.

Авторский коллектив заранее благодарен преподавателям и студентам за советы и замечания по содержанию и оформлению представленного руководства.

ИНСТРУКЦИЯ

ПО ТЕХНИКЕ БЕЗОПАСНОСТИ И ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ САНИТАРИИ ПРИ РАБОТЕ НА КАФЕДРЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ

МЕРЫ ПРОТИВОПОЖАРНОЙ БЕЗОПАСНОСТИ

1. Курение в лабораториях, служебных помещениях и коридорах категорически запрещается.

2. В случае воспламенения горючей жидкости необходимо:

-немедленно выключить электронагревательные приборы и вентиляцию;

-вынести из лаборатории все сосуды с огнеопасными жидкостями;

-при возникновении пожара вызвать противопожарную команду.

  1. Пламя необходимо гасить следующими средствами:

-при загорании жидкостей, смешивающихся с водой, любыми огнетушителями: струей воды, песком, асбестом, кошмой, суконным одеялом;

-горящие провода и электроприборы, находящиеся под напряжением, обесточить и тушить углекислым огнетушителем;

-горящие деревянные части – всеми огнегасящими средствами: сухой песок, кошма.

Лица, виновные в нарушении инструкции пожарной безопасности, несут административную и материальную ответственность.

МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С АГРЕССИВНЫМИ СРЕДАМИ

1. Проводить опыты, только предусмотренные преподавателем, соблюдая правила безопасности.

2. В химической лаборатории не ешьте, не пробуйте вещества на вкус, не наклоняйтесь над склянкой с реактивами.

3. Определяя вещество по запаху, осторожно направляйте к себе газ или пар и не делайте глубокого вдоха.

4. Будьте особенно осторожны в обращении с концентрированными кислотами, щелочами и ядовитыми веществами. Если на участки кожи или одежды попал реактив, то сначала тщательно смойте водой, затем протрите нейтрализующим реактивом.

5. Для приготовления растворов серной кислоты необходимо приливать в воду тонкой струей при непрерывном помешивании. Приливать воду в серную кислоту запрещается.

6. Жидкости, могущие причинить ожоги или отравления, запрещается брать ртом через пипетки.

МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С ЭЛЕКТРООБОРУДОВАНИЕМ И ЭЛЕКТРИЧЕСКИМИ ПРИБОРАМИ

При работе с электрооборудованием и электроприборами запрещено:

-работать с неисправным электрооборудованием;

-прикасаться руками или металлическими предметами к корпусам электроприборов и оголенным проводам;

-нарушать правила пользования электроприборами; уходя из помещения, оставлять включенными электрические установки без надзора;

-заменять перегоревший предохранитель проволочным “жучком”.

В случае загорания электропроводов или электроприборов под током, немедленно отключить ток. Загоревшиеся провода тушить углекислым огнетушителем.

Основными поражающими факторами являются: поражение электрическим током, электрической дугой, ослепление электрической дугой.

Быстрая и правильная помощь при поражении электрическим током – главное условие спасения пострадавшего.

Необходимо:

-как можно быстрее освободить его от действия электрического тока, перед этим выключив ток;

-если поблизости нет рубильника, силой отделить пострадавшего от проводника, не касаясь его тела, встав при этом на резиновый коврик, сухую фанеру или брезент;

-если на пострадавшего упал оголенный проводник под напряжением, то этот провод нужно сбросить сухой палкой или защищенной (рукавом, шарфом) рукой;

-оказать первую помощь, обеспечить пострадавшему приток свежего воздуха, дать понюхать нашатырный спирт, согреть тело растиранием, при отсутствии признаков жизни сделать искусственное дыхание;

-вызвать врача.

СЕМЕСТР 1

ЗАНЯТИЕ 1

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА В БИОХИМИИ. ЭЛЕКТРОМЕТРИЯ.

БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:

Зависимость активности ферментативных реакций от рН среды имеет большое значение для организма. Диапазон колебания рН в физиологических условиях незначителен, но на ограниченном участке клетки могут быть изменения рН, которые и влияют на активность ферментов. Знание оптимумов рН для индивидуальных ферментов важно для практической медицины. Определение рН биологических жидкостей требуется для диагностики и коррекции некоторых патологических состояний. При положительном балансе водородных ионов происходит закисление – ацидоз. Обратный процесс называется алкалозом. Электрометрический метод анализа позволяет с высокой точностью (до сотых) определять рН биологических жидкостей.

Работа 1. Определение pH биологических жидкостей с помощью рН-метра (иономера).

ОБОРУДОВАНИЕ: иономер ЭВ-74 или И – 160 М.

ПРИНЦИП МЕТОДА.

Прибор состоит из двух электродов - стеклянного и хлорсеребряного, погруженных в исследуемый раствор, электронного милливольтметра, шкала которого градуирована в единицах рХ и в милливольтах ЭДС электродной пары.

Измерительным является стеклянный электрод, потенциал которого зависит от концентрации (активности) ионов водорода в исследуемом растворе.

Хлорсеребряный электрод имеет постоянный потенциал.

ХОД РАБОТЫ.

Включить прибор в сеть. Нажать тумблер "сеть", переключатель "анионы/катионы" и нажать рХ, затем выбрать кнопку диапазонов измерения "-1 - +19".

Тщательно промыть электроды прибора водопроводной водой, ополоснуть дистиллированной водой и обтереть чистой фильтровальной бумагой. В стеклянный стаканчик налить исследуемый раствор или биологическую жидкость в таком объеме, чтобы рабочие поверхности электродов были полностью погружены в слой жидкости.

Считать результат с нижней (грубой) шкалы прибора в единицах рХ (рН).

Выбрать необходимый поддиапазон для точного (до 0,01 ед. рН) измерения рН, нажимая соответствующую кнопку на правой стороне панели прибора. Считать результат с верхней шкалы прибора.

РЕЗУЛЬТАТЫ:

Работа 2. Определение рН биологических жидкостей с помощью универсальной индикаторной бумаги (см. инструкцию на пенале).

РЕЗУЛЬТАТЫ:

ВЫВОД (Сравнить достоинства и недостатки предложенных методов):

ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:

1. Электролиты в биологических системах. Вода как слабый электролит. Ионное произведение воды.

2. Выражение концентрации водородных ионов с помощью рН. Шкала рН. Понятие о нейтральных, кислых и щелочных средах.

3. Методы определения рН растворов:

а) колориметрический, б) электрометрический.

4. Какие вещества называют индикаторами? Что такое универсальный индикатор?

5. Потенциал электрода. Электроды сравнения: водородный, хлорсеребряный. Электрод измерения. Стеклянный электрод. Устройство и принцип работы иономера.

6. рН как параметр гомеостаза. Понятие ацидоза и алкалоза. Биологическое значение поддержания постоянства внутренней среды организма.

ЗАНЯТИЕ 2

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В БИОХИМИИ.

ФОТОМЕТРИЯ.

БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:

Фотоэлектроколориметрический метод анализа относится к методам определения концентрации вещества в окрашенном растворе по интенсивности окраски. Метод широко применяется в медицине для определения концентраций окрашенных веществ в биологических жидкостях и тканях. Он может быть использован для измерения концентраций и неокрашенных веществ, если эти вещества могут быть переведены в окрашенное состояние с помощью подходящего реагента.

Работа 1. Количественное определение ионов железа в растворе фотоэлектроколориметрическим методом.

ОБОРУДОВАНИЕ: фотоэлектроколориметр КФК-2МП.

ПРИНЦИП МЕТОДА.

Колориметрический метод основан на физическом свойстве данного вещества избирательно поглощать монохроматический поток световой энергии. Степень поглощения света раствором может быть охарактеризована оптической плотностью раствора (Д), которую можно выразить как десятичный логарифм величины ослабления света (Т), т. е. Д = - LgT, где Т – это отношение I1/I0 , где I1 - интенсивность светового потока, прошедшего через слой окрашенного вещества, I0 – интенсивность падающего светового потока.

Между концентрацией вещества в растворе и величиной оптической плотности (экстинкцией) имеется прямо пропорциональная зависимость, описываемая законом Бугера-Ламберта-Беера:

D=a.l.с,

где a - молярный коэффициент светопоглощения (индивидуален для каждого вещества),

l - толщина слоя раствора,

с- молярная концентрация.

ХОД РАБОТЫ.

Построение калибровочного графика.

В три мерные колбочки на 25 мл отмеривают по 10 мл одного из стандартных растворов с концентрацией железа: 0,1 мг/мл; 0,2 мг/мл; 0,4 мг/мл.

В каждую колбочку добавляют по 1 мл салициловой кислоты для образования окрашенного комплекса и доводят объем в колбе дистиллированной водой до метки. После перемешивания перед каждым определением ополаскивают приготовленным раствором кювету (толщина кюветы 10 мм), затем заполняют ее и колориметрируют против воды. По полученным данным строят график зависимости оптической плотности от концентрации ионов железа в растворе.

ТЕХНИКА РАБОТЫ НА ФОТОЭЛЕКТРОКОЛОРИМЕТРЕ МАРКИ КФК-2-МП.

При открытой крышке прогреть ФЭК 15 минут. Установить светофильтр (для данного анализа –зеленый; длина волны 540 нм). Поставить кюветы (дальняя кювета - контроль, содержащий дистиллированную воду (растворитель), ближняя кювета - анализируемый раствор).

Установить рычаг влево. Нажать кнопку "ПУСК". Нажать кнопку "Ш0". Закрыть крышку. Нажать кнопку "К1". Перевести рычаг в правое положение. Нажать кнопку "D5". Считать результат со шкалы прибора. Перевести рычаг в левое положение. Открыть крышку. Вынуть "опытную" кювету. Протереть кюветное отделение ФЭК. Прибор готов к дальнейшим измерениям.

Определение концентрации ионов железа в исследуемом растворе (решение задачи)

В мерную колбу на 25 мл взять 10 мл исследуемого раствора, добавить 1 мл салициловой кислоты и довести объем до метки. Содержимое колбы тщательно перемешать. Измерить оптическую плотность полученного раствора на фотоэлектроколориметре и по калибровочному графику определить концентрацию ионов железа в исследуемом растворе.

Определить концентрацию можно и более простым способом, подобрав стандартный раствор, оптическая плотность которого наиболее близка к оптической плотности анализируемого раствора, и решив пропорцию:

относительно Сх.

Dст---------Сст

Dx------------Cx

С (Fe3+), мг/мл

D

0,1

0,2

0,4

РЕЗУЛЬТАТЫ (решение задачи):

Dx -

Cx -

ВЫВОДЫ:

ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:

1. Сущность колориметрического метода определения концентрации вещества в растворе. Принцип метода. Закон Бугера- Ламберта -Беера.

2. Применение фотометрического (колориметрического) метода исследования в биологии и медицине.

3. Принцип работы фотоэлектроколориметра. Его устройство. Порядок работы на фотоэлектроколориметре. Калибровочный график, его построение и использование.

ЗАНЯТИЕ 3

СТРУКТУРА И СВОЙСТВА БЕЛКОВ.

ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА БЕЛКОВ.

БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:

Белки - высокомолекулярные, полимерные соединения, состоящие из аминокислот. Определение свободных аминокислот имеет клинико-диагностическое значение при изучении обмена белков в организме. Изменение содержания аминокислот в сыворотке крови и моче наблюдаются при недостаточной функции печени: усиленном распаде белков, а также при нарушении выделительной функции почек.

Обнаружить присутствие белка и отдельных аминокислот в биологических жидкостях можно с помощью качественных реакций. Хроматографический метод исследования используется для установления аминокислотного состава гидролизатов белков, первичной структуры, а также для количественного определения свободных аминокислот в крови, моче, экссудатах и других биологических жидкостях.

Работа 1 . Анализ хроматограмм гидролизатов различных белков.

ОБОРУДОВАНИЕ: ФЭК, хроматограммы различных белков, пробирки со спиртовым раствором для экстракции.

ПРИНЦИП МЕТОДА.

Аминокислотный состав гидролизатов белков исследуется с помощью распределительной хроматографии на бумаге. Распределительная хроматография основана на способности веществ по-разному адсорбироваться на адсорбентах и по-разному растворяться в полярных и неполярных растворителях. В качестве адсорбента в данном методе используется хроматографическая бумага. Разделение проводится смесью растворителей (бутанол + ледяная уксусная кислота + вода в соотношении 4:1:5). При этом вода удерживается бумагой, а органический растворитель движется по бумаге с определенной скоростью. Вещества (в данном случае аминокислоты), растворимые в органическом растворителе, будут двигаться по бумаге вместе с растворителем. Вещества, растворимые в воде, займут на хроматограмме промежуточное положение между линией старта и линией фронта растворителя. После окончания разделения и высушивания хроматограммы ее проявляют раствором нингидрина и вновь высушивают. После этого пятна разделенных аминокислот становятся видимыми и доступными для качественного и количественного анализа.

ХОД РАБОТЫ.

Студенты исследуют готовые хроматограммы различных белков.

1. Качественный анализ хроматограмм (идентификация пятен аминокислот). Производится путем расчета коэффициентов Rf для каждого пятна:

где Rf- коэффициент распределения,

lв-ва- путь, пройденный веществом от линии старта,

lф.р.- путь, пройденный фронтом растворителя от линии старта.

Пользуясь табличными значениями Rf для каждой аминокислоты, идентифицируют аминокислоты исследуемой хроматограммы. Для расчета коэффициента измеряют расстояния от линии старта до центра каждого пятна и расстояние от линии старта до линии фронта растворителя.

Рассчитанные значения коэффициентов Rf сравнивают с табличными данными и идентифицируют таким образом все пятна аминокислот на хроматограмме.

Аминокислоты

Rf

Аминокислоты

Rf

Аланин

0.45

Треонин

0.35

Аргинин

0.20

Триптофан

0.55

Аспарагиновая к-та

0.24

Фенилаланин

0.68

Глицин

0.25

Метионин

0.55

Серин

0.27

Цистеин

0.07

Глутаминовая к-та

0.30

Цистин

0.08

Пролин

0.43

Лизин

0.12

Валин

0.60

Лейцин

0.73

2. Количественный анализ хроматограмм Окрашенные пятна, соответствующие определенным аминокислотам, вырезать ножницами, измельчить в виде щеточек и поместить для экстракции окрашенного продукта в пробирки со спиртовым раствором. Для полноты экстракции пробирки закрыть пробками и оставить на 30 мин. в темноте, время от времени встряхивая содержимое. Затем окрашенные растворы проколориметрировать на ФЭКе с зеленым светофильтром*( длина волны 540 нм; толщина кюветы 5 мм). По полученным величинам оптической плотности (D) с помощью калибровочного графика найти концентрацию каждой аминокислоты.

РЕЗУЛЬТАТЫ:

ВЫВОДЫ:

Работа 2. Определение концентрации белка в сыворотке крови рефрактометрическим методом.

ОБОРУДОВАНИЕ: рефрактометр.

ПРИНЦИП МЕТОДА.

При переходе луча света из среды оптически менее плотной в среду оптически более плотную и наоборот происходит изменение его направления, т.е. рефракция. Величина рефракции зависит от показателя преломления исследуемого вещества:

n = c/v, где

n – абсолютный показатель преломления данной среды, который указывает, во сколько раз скорость света в вакууме (с) больше скорости света в среде (v).

Показатель преломления является важной характеристикой исследуемого вещества, зависящей от химической природы, структуры и характера связей внутри молекулы и между молекулами, от их взаимодействия, плотности и концентрации исследуемого вещества. В связи с этим метод рефрактометрии используют для установления размера и формы частиц, структуры молекул, молекулярной массы веществ, для измерения концентрации веществ в рабочих растворах, в том числе в биологических жидкостях.

Для растворов зависимость концентрации от преломления определяется уравнением:

С = (n – n0) / K, где

n и n0 – соответственно показатели преломления раствора и растворителя, С – процентная концентрация вещества в растворе, К – удельный инкремент показателя преломления при увеличении концентрации раствора на 1%. Когда величина К неизвестна, концентрацию определяют методом калибровочных кривых. В обычной работе концентрацию вещества чаще устанавливают по известным таблицам соответствия ее показателю преломления. Их составляют по результатам стандартных измерений для данного вещества.



Скачать документ

Похожие документы:

  1. Каталог медицинской литературы

    Документ
    Представляем Вам наш новый каталог медицинской литературы «Осень 2009 — зима 2010 г.». Ассортимент увеличился на треть от ассортимента прошлого года и пополнился большим количеством новых уникальных изданий.
  2. А. Г. Войтов философское основание теории (Осмысление проблемы) Учебное пособие

    Учебное пособие
    Учебное пособие служит осмыслению философии как науки наук (общей теории науки) и предназначено для аспирантов, докторантов всех наук, преподавателей философии и студентов философских факультетов, а также всем, кто стремится овладеть
  3. Учебное пособие Под ред д. м н. Савельева В. Н., к э. н. Мартыненко В. Ф. Ижевск

    Учебное пособие
    Совершенствование организации здравоохранения и результативность его реформирования в значительной степени зависят от эффективности управления на всех уровнях.
  4.  естественные науки (1)

    Учебное пособие
    Г 421 Гершель, Джон. Философия естествознания: Об общем характере, пользе и принципах исследования природы : пер. с англ. / Гершель, Джон. - Изд. 2-е.
  5. Международная Книга предлагает Вашему вниманию очередной каталог книжных новинок по художественной литературе, философии, религии, истории, политике и праву, экономике, научно-технические издания и прочим рубрикам (26)

    Книга
    Международная Книга предлагает Вашему вниманию очередной каталог книжных новинок по художественной литературе, философии, религии, истории, политике и праву, экономике, научно-технические издания и прочим рубрикам.

Другие похожие документы..