Поиск

Полнотекстовый поиск:
Где искать:
везде
только в названии
только в тексте
Выводить:
описание
слова в тексте
только заголовок

Рекомендуем ознакомиться

'Рабочая программа'
Цель преподавания дисциплины является изучение ассортимента и свойств полиграфических материалов, определяющих качество и себестоимость полиграфическ...полностью>>
'Документ'
Рассмотреть проблему засорения околоземного космического пространства «космическим мусором», которая может привести к практической невозможности даль...полностью>>
'Лекция'
Сфера межличностных отношений охватывает практиче­ски весь диапазон существования человека. Можно утверж­дать, что человек, даже будучи в совершенном...полностью>>
'Документ'
Кони несут среди сугробов, опасности нет: в сто­рону не бросятся, все лес, и снег им по брюхо — пра­вить не нужно. Скачем опять в гору извилистой тро...полностью>>

Автореферат диссертации на соискание ученой степени (76)

Главная > Автореферат диссертации
Сохрани ссылку в одной из сетей:

На правах рукописи

РЯБЧЕНКО

АЛЕКСАНДР ВЛАДИМИРОВИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ЗАПАДНОСИБИРСКИХ ИЗОЛЯТОВ BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO И ИЗУЧЕНИЕ ИХ АНТИГЕННЫХ СВОЙСТВ

03.00.04 – биохимия

03.00.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск – 2009

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Беклемишев Анатолий Борисович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Ильичёв Александр Алексеевич

доктор биологический наук,

профессор Гуляева Людмила Федоровна

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск

Защита состоится « » 2009 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2; тел.: 8 (383) 333-54-81.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Научно-исследовательского института биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан «___» ___________ 2009г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук Русских Г. С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

По морфологическим и генетическим признакам различают 13 геновидов спирохет комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.) (Baranton et al, 1998), относящихся к семейству SPIROCHAETACAE. Этиологическая роль спирохет этого комплекса как инфекционных агентов, переносимых клещами рода Ixodes была установлена в 1982 г. американскими исследователями и была названа «болезнью Лайма» (Steere, 2006). В нашей стране это природноочаговое трансмиссивное заболевание получило название «иксодового клещевого боррелиоза» (ИКБ). Три геновида этого комплекса являются патогенными для человека (Wang et al, 1999) и три условнопатогенными (Richter et al, 2006; Hofmann, 2005; Stanek and Strle, 2003; Hengge et al, 2003). По широте распространения и уровню заболеваемости ИКБ занимает одно из ведущих мест среди природно-очаговых заболеваний. Ареал инфекции простирается по всей Северной Америке, Европе, России, Японии, Китае (Stanek, 2003).

Отличия в генетической структуре патогенных геновидов боррелий, обусловливают полиморфизм клинических проявлений и органных поражений человека. Основные симптомы ИКБ сходны во всем мире, но есть и региональные отличия. В первую очередь между болезнью, обнаруженной в Америке и вызываемой исключительно геновидом B.burgdorferi sensu stricto (s.s.) с характерными проявлениями артрита, и болезнью, обнаруженной в Европе. В Европе болезнь вызывается, прежде всего, геновидами B.garinii - возбудителем, характеризующимся нейротропностью и B.afzelii, поражающим часто только кожу с развитием акродерматитов. При отсутствии своевременного лечения, инфекции переходят в хроническую форму.

В виду разнообразия клинических проявлений заболевания, для подтверждения диагноза используют дополнительные лабораторные методы, среди которых широкое распространение получили методы, основанные на выявление антител к возбудителю. В качестве антигенов используются лизаты клеток боррелий, либо рекомбинантные белки спирохет. Большая изменчивость антигенов возбудителя обуславливает сложность серодиагностики. Высокая вариабельность особенно характерна для внешних поверхностных белков боррелий, которые с одной стороны являются иммунодоминантными, с другой стороны - гомология среди белков этого класса варьирует от 70 до 100% даже среди изолятов выделенных на одной территории.

Используемые для серологической диагностики белки североамериканских и западноевропейских изолятов боррелий, такие как внешние поверхностные липопротеины, флагеллярные белки, основные мембранные белки, декорин-связывающие белки и некоторые другие хорошо изучены и описаны. Однако, практически отсутствует информация об аминокислотных последовательностях и иммунохимических свойствах антигенов спирохет комплекса B. burgdorferi s.l. распространенных на территории азиатской части России. Большая протяженность территории России с запада на восток позволяет предполагать, значительное отличие антигенов в изолятах циркулирующих на этой территории. В связи с этим, целью настоящего исследования являлось получение рекомбинантных иммунодоминантных белков западносибирских изолятов B. burgdorferi s.l. и сравнительное исследование их первичных структур и антигенных свойств.

Задачи исследования:

  1. Оценить зараженность клещей Ixodes persulcatus Shulze, населяющих рекреационную зону Новосибирского Научного Центра, различными геновидами спирохет B.burgdorferi s.l.

  2. Получить культуры западносибирских изолятов B. burgdorferi s.l.

  3. На основе анализа литературных данных выбрать в качестве объектов исследования белки спирохет B.burgdorferi s.l. наиболее перспективные для создания средств серодиагностики ИКБ.

  4. Сконструировать экспрессирующиие плазмидные векторы, пригодные для получения в клетках E.coli рекомбинантных белков боррелий и их последующей аффинной очистки.

  5. Клонировать кодирующие области генов выбранных иммунодоминантных белков B.burgdorferi s.l. в клетках E.coli в составе экспрессирующих векторов.

  6. Определить нуклеотидные последовательности клонированных генов спирохет B.burgdorferi s.l. и исследовать гомологию соответствующих им белков с опубликованными в базе данных GeneBank аналогичными белками боррелий.

  7. Получить очищенные рекомбинантные белки западносибирских изолятов B.burgdorferi s.l. и исследовать их антигенные свойства методом ИФА на сыворотках больных ИКБ.

  8. Оценить пригодность каждого из рекомбинантных антигенов боррелий для серодиагностики локализованной и диссеминированной стадий ИКБ.

Научная новизна работы

Исследована зараженность клещей Ixodes persulcatus Shulze, отловленных в рекреационной зоне ННЦ в 2003, 2005, 2006 и 2008 годах, различными геновидами спирохет B.burgdorferi s.l. Отмечены зависимые от года наблюдений колебания в количестве инфицированных спирохетами особей (20% - 32%). Установлено, что только два геновида боррелий циркулировали до 2006 г. в популяции иксодовых клещей на обследованной терриртории – B.garinii и B.afzelii, с доминирующим преобладанием первого (70%-80%), включающего представителей двух геномных групп: NT29 и 20047. В 2006 и 2008 г.г. в нескольких особях клещей обнаружены спирохеты геновида B. japonica.

Сконструированы оригинальные бактериальные экспрессирующие вектора pRAC и pRAC3, содержащие химерные регуляторные районы, полилинкер для клонирования генов и участки, кодирующие олигогистидиновые последовательности в С-концевой области рекомбинантных белков. Штаммы E.coli, несущие полученные векторы обеспечивают трёхкратное увеличение синтеза белка GFP по сравнению с клетками, содержащими исходный экспрессирующий вектор pREB.

Определены нуклеотидные последовательности кодирующих областей генов flaA, flaB, ospC, ospA и dbpB западносибирского изолята B.garinii, группы 20047Т и гена ospC западносибирского изолята B.afzelii; выведены соответствующие этим генам аминокислотные последовательности белков. Нуклеотидные последовательности выше названных генов депонированы в электронную международную базу данных генетической информации GenBank под инвентарными номерами: EU979631.1, EU979630.1, EU979629.1, EU979628.1, EU979626.1 и EU979627.1.

На основе сравнения аминокислотных последовательностей антигенов FlaA, FlaB, OspC, OspA и DbpB спирохет B. burgdorferi s.l., представленных в базе данных GeneBank (декабрь 2008 г.) и установленных в настоящей работе, показано, что западносибирский изолят B.garinii группа 20047Т (NSK-10-06, музейный штамм №10) филогенетически близок изолятам B.garinii, выделенным в Европе.

Исследованы антигенные свойства рекомбинантных белков FlaA, FlaB, OspC, OspA и DbpB методом ИФА в экспериментах с сыворотками от больных ИКБ и здоровых доноров. Продемонстрирована перспективность использования названных рекомбинантных белков для серодиагностики ИКБ. Предложена комбинация рекомбинантных антигенов для выявления антител к возбудителям ИКБ в крови больных, как с локализованной, так и с диссеминированной стадиями заболевания.

Практическая значимость работы

Полученные в настоящей работе данные о зараженности клещей Ixodes persulcatus, отловленных в рекреационной зоне ННЦ в 2003, 2005, 2006 и 2008 годах, различными геновидами спирохет B.burgdorferi s.l. могут быть использованы для прогнозирования эпидемической ситуации по ИКБ и возможных клинических проявлений заболеваний.

Создана музейная коллекция западносибирских изолятов B.burgdorferi s.l. распространенных на территории Новосибирской области и определена их геновидовая принадлежность. Коллекция включает 2 изолята B.afzelii, 14 изолятов B.garinii, 7 образцов смеси изолятов B.afzelii и B.garinii. Культуры полученных изолятов боррелий могут быть использованы в качестве посевного материала для культивирования и наработки биомассы спирохет и решения исследовательских и прикладных задач.

Сконструированы векторы pRAC и pRAC3 пригодные для клонирования и эффективной индуцируемой экспрессии генов в клетках E.coli. Штаммы E.coli, содержащие в составе этих векторов экспрессируемые гены флюоресцирующих белков, могут применяться в химической, фармацевтической, пищевой промышленности и в экологическом мониторинге окружающей среды в качестве цельноклеточных биосенсоров для обнаружения генотоксикантов в исследуемых образцах.

Сконструированные штаммы E.coli - продуценты рекомбинантных белков FlaA, OspC, OspA, DbpB и FlaB, специфичных для геновидов B.garinii (группа 20047Т), и OspC B.afzelii, могут быть использованы в качестве источников получения соответствующих антигенов боррелий.

Разработана технология получения рекомбинантных белков B.burgdorferi s.l. с помощью экспрессии соответствующих им генов в составе сконструированного вектора pRAC3 и модифицированного в настоящей работе вектора pET36b(+) (pETm) в клетках E.coli (шт. BL-21(DE3) и Rosetta 2) и последующей аффинной очистки рекомбинантных полипептидов на металло-хелатных сорбентах.

Полученные в настоящей работе рекомбинантные антигены FlaA, FlaB, OspC, OspA и DbpB могут быть использованы в серодиагностике ИКБ, вызываемого спирохетами B.burgdorferi s.l., циркулирующими на азиатской территории России.

Положения, выносимые на защиту:

  1. В рекреационной зоне Новосибирского научного центра в период с 2003 по 2008 г.г. в популяции клещей Ixodes persulcatus Schulze циркулировали только три геновида боррелий – B.garinii, B.afzelii и B.japonica с доминирующим преобладанием B.garinii (более 75%). Заражённость иксодовых клещей боррелиями составляла, в зависимости от года наблюдений, 20% - 32%.

  2. Западносибирский изолят B.garinii группы 20047Т (NSK10-06, музейный штамм №10) филогенетически близок боррелиям, изолированным на территории Европы.

  3. Сконструированные плазмидные векторы pRAC, pRAC3 и модифицированный в настоящей работе вектор pET36b(+) (pETm) являются эффективными системами для экспрессии клонируемых в их составе генов в клетках E.coli.

  4. Штамм E.coli, содержащий в составе плазмиду pRAC может применяться в качестве цельноклеточного биосенсора для обнаружения генотоксикантов.

  5. По результатам исследований антигенных свойств рекомбинантных белков FlaA, FlaB, OspC, OspA и DbpB, данные белки могут быть рекомендованы для серодиагностики ИКБ.

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертационной работы доложены на следующих научных форумах: Междисциплинарный конгресс "Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека", 10-21 июня 2004, Судак, Украина; Международная конференция «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний». «Сосновка», Новосибирская область, 8-10 сентября 2004; Третий Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития", 14-18 марта, 2005 г., Москва; Московская международная конференция «Биотехнология и медицина», 14-17 марта, 2006 г., Москва.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 14 работ, из них 4 тезиса, 9 статей и один патент.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, включающих обзор литературы, материалов и методов, результатов исследований и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающих 27 отечественных и 225 зарубежных источников и приложения. Материалы диссертации изложены на 160 страницах машинописного текста, включая 5 страниц приложений. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 25 рисунками. Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ НИИ биохимии СО РАМН.

Основное содержание работы

Оценка зараженности клещей Ixodes persulcatus, населяющих рекреационную зону Новосибирского научного центра, спирохетами Borrelia burgdorferi s.l.

В работе использовали клещей Ixodes persulcatus Schulze, собранных в весенние периоды 2003, 2005, 2006 и 2008 гг. на территории Новосибирского научного центра (ННЦ). Для обнаружения и генотипирования геномных ДНК спирохет Borrelia burgdorferi s.l., выделенных непосредственно из клещей, использовали двух-этапную процедуру (Postic et al, 1994). На первом этапе определяли присутствие геномных ДНК боррелий в препаратах ДНК, выделенных из клещей, с помощью амплификации методом ПЦР межгенной области rrf-rrl (генов 5S и 23S рРНК) генома спирохет. ПЦР проводили в присутствии прямого (№ 126: 5’-TGCGAGTTCGCGGGAG-3’) и обратного (№ 127: 5’-TCCTAGGCATTCACCATAGACTCTT-3’) праймеров, причём для исключения ложноотрицательных результатов анализа, реакцию проводили в присутствие ДНК внутреннего контроля, в качестве которого служил ампликон фрагмента генома вируса гепатита В, размером 150 п.н. (Beklemishev et al., 2003). В качестве положительного контроля в ПЦР использовали геномную ДНК B.burgdorferi sensu stricto эталонного штамма В31. На втором этапе исследовали полиморфизм длин рестриктных фрагментов, полученных гидролизом ампликонов межгенной области rrf-rrl эндонуклеазами рестрикции MseI или Tru9I. Поскольку представителям каждого геновида геномной группы спирохет B.burgdorferi s.l. свойственен определённый набор отличающихся по размерам рестриктных фрагментов ампликона межгенной области rrf-rrl (Postic et al, 1996), то по результатам электрофоретического анализа полученных рестриктов можно судить о геновидовой принадлежности боррелий, содержащихся в исследуемом клеще.

На рис. 1 представлены результаты типичного анализа ПДРФ ампликонов межгенной области rrf-rrl, полученных на исследуемых образцах ДНК клещей.

Рис. 1. Электрофореграмма рестриктных фрагментов ампликонов межгенной области, полученных в процессе генотипирования анализируемых образцов ДНК B.burgdorferi s.l. Электрофорез проводили в 12% ПААГ.

Дорожки: 1, 14 - маркеры молекулярных масс ДНК (pBR322, гидролизованная HaeIII); 2-13 - ампликоны межгенной области rrf-rrl анализируемых образцов ДНК B.burgdorferi s.l., гидролизованные рестриктазой MseI.

На рис. 1 видно, что 7 исследуемых образцов (дорожки 2, 4, 7, 10-13) содержат геномную ДНК спирохет, относящихся к геновиду B.garinii (геномная группа 20047T); 1 образец (дорожка 3) – к геновиду B.japonica; 1 образец (дорожка 8) – к геновиду B.afzelii; 1 образец (дорожка 6) содержат смесь геномных ДНК спирохет B.garinii (геномные группы NT29 и 20047T); 1 исследуемый образец (дорожка 9) содержат смесь геномных ДНК спирохет B.japonica и B.garinii 20047T.

За 6-ти летний период мониторинга заражённости боррелиями иксодовых клещей, населяющих рекреационную зону ННЦ, было установлено, что в этой популяции клещей, циркулируют два патогенных для человека геновида спирохет B.burgdorferi s.l.: B.garinii и B.afzelii, и один непатогенный геновид - B.japonica. Результаты этих исследований представлены в таблице 1.

Доминирующим геновидом являются спирохеты B.garinii, включающие представителей двух геномных групп: NT29 и 20047T (с преобладанием подгруппы 20047T), и обнаруживаемые в более чем 75% инфицированных спирохетами клещей. Зараженность иксодовых клещей спирохетами Borrelia burgdorferi s.l., колебалась в зависимости от года наблюдений в пределах 20% - 32%. Средняя годичная зараженность за весь наблюдаемый период составила 22,4±1,1%. С 2006 г. на территории Новосибирской области зафиксировано появление геновида B.japonica, распространённого в популяции клещей в Японии и на Дальнем Востоке РФ.

Таблица 1. Заражённость взрослых клещей I. persulcatus, отловленных в рекреационной зоне ННЦ в весенний период 2003 – 2008 г.г., различными геновидами спирохет B. burgdorferi s.l.

Год

Кол-во клещей

ПЦР-позитив-ные клещи, (%)

Количество генотипированных ПЦР-позитивных образцов ДНК из клещей

общее

кол-во

B garinii NT29

B.garinii 20047T

B.afzelii

B.japonica

mix

2003

210

31,7±6,0

37

10

14

3

-

10

2005

306

21,2±2,3

64

8

31

15

-

10

2006

590

26,1±1,8

154

13

97

20

6

24

2008

303

20,1±2,3

61

6

53

2

5

-

2

1409

22,4±1,1

316

37

195

40

11

44

1 Общая средняя ежегодная зараженность клещей за весь наблюдаемый период.

mix – смесь геновидов B.afzelii и B.garinii.

Доля позитивных клещей определялась как p ± SD, по формулам:

p = P/n * 100% (1);

SD = √р*(100 – p)/n (2);

где Р – количество позитивных особей в конкретной выборке, n – величина выборки.

Изоляция и культивирование спирохет Borrelia burgdorferi s.l.

Изоляцию и выращивание боррелий проводили на среде BSK II, в двух вариантах: прямое культивирование из клещей и с использованием лабораторных мышей в качестве природного фильтра. При выращивании боррелий непосредственно из клещей I.persulcatus, в качестве посевного материала использовали гомогенат клещей. По 5 особей клещей гомогенизировали в среде BSK II, хитиновые оболочки осаждали центрифугированием, а надосадочную жидкость инокулировали в пробирки со средой. Пробы инкубировали 15 суток при 320С, после чего культуры пересевали на свежую среду BSK II и выращивали еще 15 дней. Культивирование в общей сложности проводили в течение месяца. Во втором варианте, гомогенат клещей инъецировали животным внутрибрюшинно. Мышей после инъекций содержали 20 дней в виварии, затем кровь, сердце и мочевой пузырь извлекали и помещали в культуральную среду BSK II. Далее процедура была аналогична той, которая описана для культивирования боррелий из клещей. В результате этой работы нами было получено 37 изолятов боррелий, среди которых 24 изолята B.garinii; 3 изолята B.afzelii; и 10 образцов культур были представленны смесью изолятов B.garinii и B.afzelii. Полученные культуры использовали в качестве стабильного источника выделения ДНК спирохет и последующей амплификации методом ПЦР генов иммунодоминантных антигенов боррелий.

Выбор белков спирохет Borrelia burgdorferi s.l., перспективных для серодиагностики ИКБ

Известно, что спирохеты Borrelia burgdorferi s.l. характеризуются высокой антигенной изменчивостью. В связи с этим большую сложность представляет решение проблемы создания универсальных тестов для серодиагностики ИКБ. Принципиальное значение приобретает рациональный выбор антигенов боррелий и подбор их композиций для создания диагностических систем. На основе проведённого нами анализа литературных данных, наибольший интерес, с точки зрения создания тестов для серодиагностики ИКБ, представляют внешние поверхностные белки OspC и OspA, флагеллярные белки FlaA и FlaB и декоринсвязывающий белок DbpB. Белки OspC, FlaA и FlaB являются одними из первых антигенов индуцирующих иммунный ответ на ранней стадии инфекции ИКБ. Антигены OspA и DbpB индуцируют иммунный ответ на стадии диссеминированной инфекции и при хронизации болезни. Однако какие-либо сведения о первичной структуре генов этих белков для сибирских изолятов Borrelia burgdorferi s.l. в литературе отсутствовали. В связи с этим мы поставили перед собой задачу клонировать белок-кодирующие области этих генов, определить их первичные структуры, получить кодируемые ими рекомбинантные белки и исследовать их антигенные свойства.



Скачать документ

Похожие документы:

  1. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (8)

    Автореферат диссертации
    Защита состоится «11» _октября__ 2011 г. в 11. 00 час. на заседа­нии диссертационного совета Д 203.019.02 при Московском университете МВД России (117997, Москва, ул.
  2. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (107)

    Автореферат диссертации
    Защита диссертации состоится «13» сентября 2007 года в 1515 часов на заседании Диссертационного Совета Д.501.001.74 в Московском государственном университете им.
  3. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (121)

    Автореферат диссертации
    Защита состоится 26 декабря 2008 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д.212.241.01 при Саратовском государственном социально-экономическом университете по адресу: 41 3, г.
  4. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (228)

    Автореферат диссертации
    Актуальность исследования. Познание человеком самого себя во всем многообразии культурных феноменов и форм – вечная проблема философии, и по сей день не утратившая своей актуальности.
  5. Автореферат Диссертации на соискание ученой степени (199)

    Автореферат диссертации
    Защита состоится 23 декабря 2009 г. в 16.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 602.004.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Санкт-Петербургском Гуманитарном университете профсоюзов по адресу:
  6. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (43)

    Автореферат диссертации
    Защита состоится 20 сентября 2007 года в 14-00 часов на заседании диссертационного совета Д 003.027.01 при Институте монголоведения, буддологии и тибетологии СО РАН по адресу 670047, г.

Другие похожие документы..