Поиск

Полнотекстовый поиск:
Где искать:
везде
только в названии
только в тексте
Выводить:
описание
слова в тексте
только заголовок

Рекомендуем ознакомиться

'Автореферат'
Защита диссертации состоится « 29 » февраля 2012 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного Совета Д 208.126.01 в ФГБУ Эндокринологического научн...полностью>>
'Книга'
Книга К. Леонгарда «Акцентуированные личности» на русском языке первым изданием вышла в 1981 г. Она была с большим интересом встречена советским и за...полностью>>
'Закон'
В соответствии с постановлением Правительства Российской Федерации от 15 февраля 2011 г. № 74 "О правилах обязательного медицинского страхования&...полностью>>
'Реферат'
В условиях рыночной экономики важнейшей задачей любого субъекта хозяйствования является постоянный контроль за объемом продаж и доходами, поскольку п...полностью>>

Учреждение Российской академии медицинских наук Российский онкологический научный центр имени Н. Н. Блохина рамн директор, академик ран и рамн м. И

Главная > Автореферат
Сохрани ссылку в одной из сетей:

На правах рукописи

КОЖЕМЯКИНА

НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА

СОСТАВ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ УГЛЕВОДНЫХ КОМПОНЕНТОВ МИЦЕЛИЯ НЕКОТОРЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ

03.02.03 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Санкт-Петербург

2010

Работа выполнена на кафедре микробиологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ

Научный руководитель:

Доктор технических наук,

профессор Галынкин Валерий Абрамович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук,

профессор, з.д.н. РФ Елинов Николай Петрович

Кандидат биологических наук Няникова Галина Геннадьевна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских наук Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина РАМН (директор, академик РАН и РАМН М.И. Давыдов)

Защита состоится « 15 » ноября 2010 года в 13 часов на заседании диссертационного совета ДМ 001.022.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, Каменноостровский проспект, д. 69/71, конференц-зал НИИЭМ СЗО РАМН.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Научно-исследовательского института экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН, по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. академика Павлова, д. 12.

Автореферат разослан « 14» октября 2010 года

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук А.Н. Суворов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Базидиомицеты являются перспективными микробиологическими объектами, которые привлекают внимание исследователей как источники профилактических и лечебных средств, оказывающих общеукрепляющее, тонизирующее и иммуностимулирующее действие на организм человека. Биологическая активность базидиомицетов определяется наличием в них ряда компонентов, важнейшими из которых являются гликаны (полисахариды) (Bao X.F., 2002; Wasser S.P., 2005). Одно из главных достоинств грибных гликанов заключается в отсутствии токсичности, при этом они способны оказывать стимулирующее действие на различные звенья иммунитета и корректировать патологические состояния, связанные с нарушением функций иммунной системы, приводя их к норме. (Akramiene D., 2007; Israilides C., 2008; Goodridge H., 2009). Помимо этого, гликаны некоторых базидиомицетов обладают противоопухолевой активностью (Lin Z., 2004; Chen J., 2007; Shimizu K., 2009). В настоящее время препараты на их основе не используют в онкологической практике в качестве единственных средств для лечения раковых заболеваний из-за недостаточной эффективности, но активно ведутся исследования по их применению в комплексной терапии раковых больных и в качестве средства поддерживающей терапии (Wasser S.P., 1999; Горовой Л.Ф., 2006). Существенным достоинством грибных гликанов, помимо действия на опухоли, является способность значительно снижать побочные эффекты химио- и радиотерапии (Gao Y. et al., 2002; Wang D.H., Weng X.C., 2006). Ранее, объектом исследования служили в основном плодовые тела грибов, часто дикорастущие, хотя, очевидно, что более перспективным является получение мицелия при глубинном культивировании грибов, когда удается осуществлять направленный синтез целевого продукта, стандартизовать условия его получения и показатели качества, сократить длительность процесса. В глубинной культуре грибы на протяжении всего жизненного цикла образуют микроскопические структуры, то есть являются микромицетами. Состав глубинного мицелия по всем важнейшим показателям, в том числе и по содержанию структурно-функциональных полисахаридов, качественно превосходит состав плодовых тел грибов (Бабицкая В.Г., 2005). В связи с возросшим интересом к базидиомицетам перспективно всестороннее исследование новых представителей данного класса, особенно в условиях погруженного культивирования, с целью получения на основе их мицелия профилактических и лечебных средств для поддержания иммунной системы в норме и при патологических состояниях.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении особенностей роста базидиомицетов Ganoderma applanatum, Fomes fomentarius и Flammulina velutipes в условиях глубинного культивирования; исследовании полисахаридных компонентов мицелия и экзополисахаридов, оценке их биологической активности.

В соответствии с целью исследования в работе были поставлены следующие конкретные задачи:

1) изучить особенности роста базидиальных грибов в глубинных условиях и подобрать условия культивирования для накопления максимального количества биомассы мицелия грибов;

2) выделить полисахаридные компоненты мицелия и экзогликаны, исследовать их состав и физико-химические свойства;

3) оценить иммунобиологические свойства мицелия грибов, эндо- и экзополисахаридов по их влиянию на показатели функциональной активности перитонеальных макрофагов мышей, отражающие стадии фагоцитоза;

4) исследовать в системе in vivo (на экспериментальных моделях опухолевого роста) противоопухолевую активность углеводных компонентов мицелия.

Научная новизна исследования. В работе впервые изучены особенности роста базидиальных грибов Ganoderma applanatum (Pers.) Pat. штамм 9, Flammulina velutipes (Curtis: Fr.) P. Karst. штамм 20 и Fomes fomentarius (L.:Fr.) Fr. штамм 6 в условиях погруженного (глубинного) культивирования. Путем водной экстракции из мицелия выделены растворимые и нерастворимые полисахаридные фракции. Установлено, что нерастворимые фракции представляют собой хитин-глюкановые комплексы, а водорастворимые – смесь гетерополисахаридов, состоящих из глюкозных, маннозных и галактозных остатков. Gapplanatum в глубинных условиях синтезирует внеклеточный гетерогликан, сходный по составу и физико-химическим характеристикам с растворимой полисахаридной фракцией мицелия.

Показано, что полисахаридные компоненты мицелия исследуемых грибов оказывают активирующее действие на клетки системы мононуклеарных фагоцитов, в частности перитонеальные макрофаги мышей, что проявляется в усилении хемотаксиса, адгезии, увеличении поглотительной способности и микробоцидности макрофагов. Растворимые фракции более активны по сравнению с нерастворимыми. Мицелий грибов при пероральном введении проявляет менее выраженное действие на функциональную активность макрофагов, чем углеводные фракции. Установлено, что растворимая углеводная фракция мицелия Gapplanatum, наряду с высоким стимулирующим действием на макрофаги, обладает значительным и продолжительным противоопухолевым эффектом в отношении асцитной опухоли Эрлиха.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований выбрана культура G. applanatum штамм 9 для использования в качестве продуцента биологически активных углеводных полимеров, так как она обеспечивала достаточно высокий прирост биомассы, и компоненты мицелия обладали выраженной биологической активностью. Экспериментально подобраны состав питательной среды и условия культивирования для наибольшего накопления биомассы (выход вырос на 30% по сравнению с исходными условиями), при этом сроки ферментации сократили с 14 до 8 суток. Установлено, что растворимая полисахаридная фракция мицелия G. applanatum обладает выраженной противоопухолевой активностью, что, в сочетании с безвредностью, служит основанием для разработки на её основе средств, перспективных в комплексной терапии онкологических заболеваний. Разработан лабораторный регламент на получение биологически активной субстанции «Ганодермин».

Результаты работы внедрены в курсы лекций и лабораторные занятия по дисциплинам «Основы конструирования новых штаммов микроорганизмов» для студентов 3 курса и «Микробиология продуцентов БАВ» для студентов 4 курса факультета промышленной технологии лекарств СПХФА. Рабочие программы курсов утверждены 16.06.2009 г методической комиссией факультета промышленной технологии лекарств СПХФА.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Подбор условий культивирования базидиальных грибов Gapplanatum, Ffomentarius и Fvelutipes и изучение особенностей их роста в глубинных условиях привели к повышению выхода биомассы мицелия и сокращению сроков культивирования.

  2. Растворимые углеводные фракции мицелия грибов, представляют собой смесь гетерополисахаридов, состоящих преимущественно из глюкозных, маннозных и галактозных остатков, нерастворимые – хитин-глюкановые комплексы. Основным углеводным компонентом фракций является глюкоза.

  3. Gapplanatum в условиях глубинного культивирования синтезирует экзогетерогликан, сходный по составу и физико-химическим характеристикам с растворимой полисахаридной фракцией мицелия.

  4. Полисахаридные компоненты мицелия грибов Gapplanatum, Ffomentarius, Fvelutipes и экзополисахарид Gapplanatum оказывают стимулирующее действие на клетки системы мононуклеарных фагоцитов, в частности на перитонеальные макрофаги мышей, что проявляется в увеличении показателей их функциональной активности, отражающих стадии фагоцитоза. Наиболее активны растворимые углеводные фракции мицелия.

  5. Растворимый эндополисахарид Gapplanatum обладает выраженной длительной противоопухолевой активностью в отношении асцитной опухоли Эрлиха; нерастворимые фракции Gapplanatum и Ffomentarius обладают умеренной противоопухолевой активностью.

Личное участие автора заключалось в проведении всех лабораторных исследований, обобщении и анализе полученных результатов.

Апробация работы. Результаты исследований обсуждены на заседаниях кафедры микробиологии ГОУ ВПО СПХФА, доложены на VI и VII международных форумах «Биотехнология и современность» (Санкт-Петербург, 2005 г, 2006 г), научной конференции СПХФА «Подготовка кадров для фармацевтической промышленности» (Санкт-Петербург, 2006 г), региональной научной конференции СПХФА «Молодые ученые практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007 г). Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ кафедры микробиологии ГОУ ВПО СПХФА.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 3 в журналах, рекомендуемых ВАК для опубликования результатов диссертационной работы.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста (150 стр. вместе с приложениями) и состоит из введения, обзора литературы, результатов, обсуждения, выводов, указателя литературы, включающего 100 отечественных и 115 иностранных источников. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 18 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Представлен обзор научных публикаций по теме диссертации. Рассмотрены сведения о различных способах культивирования базидиомицетов. Проанализированы данные, касающиеся условий культивирования, в том числе источников углеродного и азотного питания, входящих в состав питательных сред; температуры и аэрации. Показано, что биологическая активность базидиальных грибов определяется наличием в их мицелии, культуральной жидкости и плодовых телах веществ полисахаридной природы. Рассмотрены особенности строения грибных гликанов, связь между структурой и биологической активностью, а также основные механизмы их противоопухолевого и иммуностимулирующего действия. На основании обзора литературы сформулированы цель и задачи исследования.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе исследовали мицелиальные культуры Ganoderma applanatum (Pers.) Pat. штамм 9, Flammulina velutipes (Curtis: Fr.) P. Karst. штамм 20 и Fomes fomentarius (L.:Fr.) Fr. штамм 6, полученные из коллекции Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета). Объекты исследования: мицелий грибов; выделенные из него растворимые (РФр) и нерастворимые углеводные фракции (НФр); экзополисахарид G. applanatum (ЭПС).

Поверхностное культивирование грибов проводили в термостатируемых условиях на агаризованных средах: сусло-агаре (7Б), агаре Сабуро, среде Чапека-Докса, глюкозо-пептонной среде и фармакопейной среде №2 (ГФ РФ XII, ч.1, 2008) при 24  1С в течение 14 суток. Глубинное культивирование проводили в жидком сусле (ЖС, 7Б) и глюкозо-пептонной среде (ГПС) (Koroleva-Skorobogatko О. et al., 1998) в динамических (120 об/мин) и статических условиях при температуре 241С в течение 14 суток. Концентрацию биомассы определяли весовым способом. Питательные среды инокулировали агаровыми блоками диаметром 10 мм (1 блок на чашку Петри, 10 блоков на колбу), или четырехсуточной глубинной культурой, выращенной на ГПС в количестве 10% от объёма среды.

Экзополисахарид Gapplanatum выделяли из сконцентрированного нативного раствора 96% этиловым спиртом в соотношении 1:2. Для выделения углеводных фракций сухой измельченный мицелий заливали очищенной водой в соотношении 1:10, выдерживали на кипящей водяной бане в течение 8 ч. Полученную суспензию центрифугировали (15 мин, 5000 g), осадок (нерастворимую фракцию НФр) промывали этанолом (1:1) на центрифуге, обрабатывали ацетоном, высушивали до получения постоянного веса. Из упаренного в 2 раза супернатанта осаждали полисахарид 96% этиловым спиртом в соотношении 1:2, образовавшийся осадок (растворимую фракцию РФр) отделяли центрифугированием (15 мин, 5000 g), обрабатывали ацетоном и сушили до постоянного веса.

Содержание редуцирующих веществ, белка, минеральных примесей в мицелии грибов, эндо- и экзополисахаридах; -аминного азота и редуцирующих сахаров в культуральной жидкости определяли с использованием стандартных методик (ГФ РФ XII, ч.1, 2008; Захарова И.Л., Косенко Л.В., 1982; Ленинджер А., 1985).

Качественный моносахаридный состав в гидролизатах определяли с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках«Silufol» в системе н-бутанол–вода–этанол–аммиак (40:49:10:1). Количественный моносахаридный состав определяли методом ГЖХ в виде триметилсилильных (ТМС) производных сахаров на колонке НР-5 (SE-54) 30 м×0.25 мм×0.25 мкм на приборе «Кристалл» («Хромотек», Россия). ИК-спектры поглощения фракций снимали на инфракрасном Фурье-спектрометре ФСМ 1201 (АО «СПб Инструментс», Россия). Соотношение гликозидных связей во фракциях определяли методом перйодатного окисления (Захарова И.Л., Косенко Л.В., 1982). Удельное вращение растворимых фракций и экзогликана определяли на автоматическом поляриметре Perkin-Elmer-241 (PerkinElmer, США), молекулярно-массовое распределение – методом гель-хроматографии на колонке, заполненной сефарозой-4В.

Иммунобиологическое действие мицелия грибов и полученных из него фракций оценивали по их влиянию на показатели функциональной активности перитонеальных макрофагов мышей, отражающие стадии фагоцитоза: хемотаксис, распластывание фагоцитов на стекле, их микробоцидность по отношению к клеткам Staphylococcus aureus (штамм 209) и поглотительную способность в отношении клеток Candida albicans (штамм АТСС 855-263) (Фримель Г., 1987).

Определение острой токсичности проводили по экспресс-методу Прозоровского и унифицированному методу Миллера–Тейтнера (Прозоровский В.Б. и соавт., 1978; Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2005).

Противоопухолевую активность фракций определяли на мышах-самцах с перевитой асцитной опухолью Эрлиха (Стуков А.Н., 2001).

Статистическую обработку результатов производили по методу Стьюдента-Фишера и с использованием непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни (U-тест). Достоверными считались различия между группами при p<0,05. Повторность всех экспериментов составляла не менее 5-ти раз (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2005).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Культивирование базидиомицетов

При культивировании на плотных питательных средах наиболее интенсивный рост мицелия грибов наблюдали на сусло-агаре. Скорость роста мицелия при температуре 24°С составила в среднем для Gapplanatum – 2,0 мм/сут, Ffomentarius – 1,5 мм/сут и Fvelutipes – 1,2 мм/сут. На указанной среде рост культур был типичным для соответствующих видов. Ffomentarius образовывал плоские ватно-войлочные колонии белого цвета, в центре пигментированные в желто-бежевый цвет, со слаборазвитым воздушным мицелием; Fvelutipes – колонии белого цвета, выпуклые, округлые, с ровным краем, с сильно развитым воздушным ватообразным мицелием ярко-белого цвета; у Gapplanatum воздушный мицелий был слаборазвит, белого цвета, субстратный – не пигментирован, при старении культуры мицелий приобретал окраску от желто-золотистой до светло-коричневой. При длительном культивировании Gapplanatum (больше 2-х недель) на поверхности мицелия появлялись структуры в виде «губок». Остальные плотные питательные среды осваивались мицелием грибов менее интенсивно. Общим микроморфологическим признаком для всех изученных грибов было наличие регулярносептированного мицелия с одиночными пряжками, часто без просвета, характерными для базидиомицетов.

Глубинное культивирование мицелия проводили в жидких питательных средах: ГПС и ЖС. Интенсивное накопление биомассы мицелия наблюдали на ЖС (10–14 г/л), однако, использование этой среды создавало трудности при выделении и очистке углеводных фракций; поэтому для дальнейших исследований была выбрана ГПС. Для повышения выхода биомассы мицелия варьировали источники углеродного (рис. 1) и азотного питания (рис. 2), входящие в состав ГПС.

Рис. 1. Влияние источников углерода в питательной среде на выход биомассы мицелия грибов (p<0,05)

По оси абсцисс:

1, 2, 3 – варианты среды с глюкозой в концентрации 10; 7 и 5 г/л соответственно;

4 – среда с растворимым крахмалом; 5 – среда с нерастворимым крахмалом;

6 – среда с сахарозой.

По оси ординат: Б – выход биомассы мицелия, г/л.

Для исследуемых культур оптимальным источником углерода была глюкоза в концентрации 10 г/л. Замена глюкозы на другие источники углерода (сахарозу, крахмал) или снижение её концентрации в среде приводили к значительному снижению выхода мицелия (на 17–94%). Повышение концентрации глюкозы в среде (выше 10 г/л) было нецелесообразным, так как не приводило к существенному увеличению выхода биомассы.

Рис. 2. Влияние источников азота в питательной среде на выход биомассы мицелия грибов (p<0,05)

По оси абсцисс: 1 – среда с пептоном;

2 – среда с пептоном и дрожжевым экстрактом;

3 – среда с пептоном и дрожжевым автолизатом.

По оси ординат: Б – выход биомассы мицелия, г/л.

В ходе экспериментов установили, что при внесении в ГПС дополнительно к пептону (основному источнику азота в ГПС) дрожжевого автолизата в концентрации 20 мл/л выход мицелия увеличился на 40–70%. Было показано, что исследуемые грибы хорошо усваивали органические формы азота и практически не усваивали источники неорганического азота (натрия нитрат и аммония сульфат). Соотношение С:N в подобранной глюкозо-пептонной среде, содержащей 10 г/л глюкозы, 20 мл/л дрожжевого автолизата и 2,5 г/л пептона, составило 35:1.

Установили, что культуры на ГПС росли в широком диапазоне начальных значений рН среды (от 3,0 до 7,5) (рис. 3).

Рис. 3. Влияние исходного рН среды на выход биомассы мицелия (p<0,05)

По оси абсцисс: исходные значения рН среды (ГПС).

По оси ординат: Б – выход биомассы мицелия, г/л.

Оптимальное значение рН среды для роста Gapplanatum составило 5,0, Fvelutipes, Ffomentarius – 6,0. Для дальнейших исследований было принято исходное значение рН среды – 6,0.

Динамические условия культивирования были более благоприятны для накопления биомассы, чем статические: выход биомассы Gapplanatum и Ffomentarius в динамических условиях был в 2 раза выше, а у Fvelutipes – в 7 раз выше, чем в статических условиях (p<0,05). На жидких средах в статических условиях культуры образовывали войлочные пленки различной толщины, при выращивании в динамических условиях – пеллеты (крупные шарообразные скопления биомассы, состоящие из клеток мицелия) диаметром 0,2–1,0 см. В крупных глобулах наблюдали зональность, полости. При микроскопии глубинного мицелия обнаружили активно ветвящиеся гифы, с одиночными крупными пряжками. Использование вегетативного посевного материала в форме пеллет вместо агаровых блоков способствовало повышению выхода биомассы мицелия в 1,5–2,0 раза, сроки культивирования при этом сократились на 4–5 суток. В результате подбора условий культивирования выход биомассы мицелия Gapplanatum увеличился на 30%, Ffomentarius – на 23%, Fvelutipes – на 39% по сравнению с выходом в исходных условиях (p<0,05), и составил 6,0; 4,8 и 5,5 г/л соответственно.

Была изучена динамика развития грибов на подобранной среде в глубинных условиях (рис. 4). В течение первых 4-х суток культивирования происходило незначительное потребление грибами источников углерода и азота. Резкое уменьшение содержания глюкозы в среде наблюдали на 5-е, аминного азота – на 7-е сутки (при культивировании Ffomentarius на 4-е сутки). К 10-м суткам происходила почти полная утилизация культурами питательных веществ, при этом значительное накопление биомассы наблюдали со 2-х по 8-е сутки ферментации. Максимальная продуктивность мицелия Gapplanatum, Fvelutipes и Ffomentarius составила 1,2 г/лсут, 1,3 г/лсут и 1,0 г/лсут соответственно. Значение рН среды к 5–6-м суткам снижалось с исходного 6,0 до 3,5–3,8; с 8-х суток наблюдали повышение значения рН до 4,8–7,5. Возможно, рост культур после исчерпания источников питания в среде происходил за счет потребления продуктов ЦТК в качестве субстрата, что могло являться причиной подъёма рН.

Таким образом, были изучены морфолого-культуральные и микроморфологические характеристики культур при росте на плотных и жидких питательных средах, подобраны состав среды и условия для накопления биомассы мицелия. На основании полученных результатов было предложено сокращение сроков культивирования исследуемых базидиомицетов с 14 до 8 суток.

а

б

в

г

Рис. 4. Динамика утилизации источников углерода (а) и азота (б),

изменения рН (в) и накопления биомассы (г) в процессе глубинного культивирования

По оси абсцисс: время культивирования.

По оси ординат: а) N – концентрация α-аминного азота, мг/мл;

б) С – концентрация сахаров, мг/мл;

в) рН – значения рН среды в процессе культивирования;

г) Б – выход биомассы мицелия, г/л.

1 – F. fomentarius; 2 – G. applanatum; 3 – F. velutipes.



Скачать документ

Похожие документы:

  1. Российская академия медицинских наук научные разработки ниу рамн практическому здравоохранению (2)

    Документ
    Результаты научных исследований, готовые к практическому применению, обобщены Организационно-аналитическим управлением РАМН по материалам, представленным научно-исследовательскими учреждениями РАМН.
  2. Научно-учебный центр свс мисис-исман (нуц свс)

    Документ
    1.1. Научно-учебный центр СВС МИСиС-ИСМАН (НУЦ СВС) был создан совместным приказом-постановлением Гособразования СССР и Президиума АН СССР № 744/119 от 21.
  3. Российская академия наук справочник 2007 Часть II москва «Наука» 2007 список сокращений (1)

    Справочник
    пед.н. - доктор педагогических наук к.пед.н. - кандидат -"-"- д.полит.н. - доктор политических наук к.полит.н. - кандидат -"-"- д.
  4. Российская академия наук справочник 2007 Часть II москва «Наука» 2007 список сокращений (2)

    Справочник
    пед.н. - доктор педагогических наук к.пед.н. - кандидат -"-"- д.полит.н. - доктор политических наук к.полит.н. - кандидат -"-"- д.
  5. Каталог медицинской литературы

    Документ
    Представляем Вам наш новый каталог медицинской литературы «Осень 2009 — зима 2010 г.». Ассортимент увеличился на треть от ассортимента прошлого года и пополнился большим количеством новых уникальных изданий.

Другие похожие документы..